umwelt-online: Verordnung (EG) Nr. 440/2008 zur Festlegung von Prüfmethoden gemäß der VO (EG) Nr. 1907/2006 zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH) (41)

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C.38. Der Amphibien-Metamorphose-Assay (AMA) ¹⁶

Einleitung

1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 231 (2009). Angesichts des Risikos, dass in der Umwelt vorhandene Chemikalien Menschen und wild lebende Pflanzen und Tiere beeinträchtigen könnten, muss eine Prüfung zum Nachweis von auf das Schilddrüsensystem von Vertebraten wirkenden Chemikalien entwickelt und validiert werden. 1998 hat die OECD eine prioritäre Aktivität zur Änderung bestehender technischer Leitlinien zum Screening und zum Testen von Chemikalien mit potenziell endokriner Wirkung initiiert. Ein Element dieser Aktivität bestand in der Entwicklung einer technischen Leitlinie für das Screening von Chemikalien, die auf das Schilddrüsensystem von Wirbeltierarten wirken. Vorgeschlagen wurde eine zum einen die Überarbeitung der Studie zur Toxizität bei Nagetieren nach wiederholter 28-tägiger oraler Gabe (Kapitel B.7 in diesem Anhang) und zum anderen die Entwicklung des Amphibien-Metamorphose-Assays (AMA). Die überarbeitete Prüfmethode B.7 wurde einer Validierung unterzogen und anschließend veröffentlicht. Der Amphibien-Metamorphose-Assay (AMA) wurde ebenfalls in einem umfassenden Validierungsprogramm mit Intra- und Interlaborstudien untersucht, in denen die Relevanz und die Zuverlässigkeit des Tests nachgewiesen wurden ( 1, 2). Anschließend wurde der Test einem Peer-Review durch eine Gruppe unabhängiger Experten unterzogen ( 3). Diese Prüfmethode beruht auf den Erfahrungen aus Validierungsstudien zum Nachweis von auf die Schilddrüse wirkenden Chemikalien und auf Arbeiten in anderen OECD-Mitgliedsländern.

Prinzip der Prüfung

2. Der Amphibien-Metamorphose-Assay (AMA) ist ein Test zur empirischen Bestimmung von Chemikalien, die das normale Funktionieren der Hypothalamus-Hypophysen-Schilddrüsen-Achse (HPT-Achse) beeinträchtigen können. Der AMa stellt ein generalisiertes Vertebratenmodell dar, das auf den konservierten Strukturen und Funktionen der HPT-Achse beruht. Der Test ist deshalb von Bedeutung, weil die Metamorphose von Amphibien einen gut untersuchten schilddrüsenbezogenen Prozess darstellt, der auf in der HPT-Achse wirksame Chemikalien reagiert. Außerdem ist dieser Test der einzige Test mit dem thyroidale Aktivität in einem Tier während der Metamorphose nachgewiesen werden kann.

3. Das allgemeine Prüfprotokoll sieht die Exposition von Krallenfrosch-Larven (Xenopus-laevis) des Stadiums 51 durch mindestens drei verschiedene Konzentrationen einer Prüfchemikalie und eine Verdünnungswasserkontrolle über einen Zeitraum von 21 Tagen vor. Für jede Prüfkonzentration werden vier Replikate verwendet. Zu Beginn des Tests werden bei allen Behandlungsgruppen 20 Larven pro Prüfbecken eingesetzt. Als Endpunkte werden die Länge der Hinterbeine, die Kopf-Rumpf-Länge, das Entwicklungsstadium, die Feuchtmasse, die Histologie der Schilddrüse und die tägliche Mortalität erfasst.

Beschreibung der Methode

Prüfspezies

4. Der Krallenfrosch (Xenopus laevis) wird weltweit in Labors kultiviert und ist im Handel ohne Weiteres zu beschaffen. Bei dieser Art kann die Reproduktion ganzjährig leicht durch Injektionen von humanem Choriongonadotropin (hCG) angeregt werden; die entstehenden Larven können in großer Anzahl bis zu den gewünschten Entwicklungsstadien aufgezogen werden, die dann in auf bestimmte Stadien bezogenen Prüfprotokollen verwendet werden können. Die im Test zu verwendenden Larven sollten vorzugsweise von im jeweiligen Labor gezogenen adulten Tieren stammen. Alternativ (wenngleich nicht als bevorzugtes Verfahren) können auch Eier oder Embryos an die mit dem Test beauftragten Labors geschickt werden; in den Labors muss dann eine gewisse Akklimatisierungszeit vorgesehen werden. Der Versand von Larven ist bei diesem Test nicht annehmbar.

Ausrüstung und Verbrauchsmaterial

5. Zur Durchführung dieses Tests werden die folgende Ausrüstung und die folgenden Verbrauchsmaterialien benötigt:

1. Expositionssystem (siehe folgende Beschreibung);
2. Aquarien aus Glas oder Edelstahl (siehe folgende Beschreibung);
3. Brutbecken;
4. Temperaturregelung (z.B. Heiz- oder Kühlgeräte, einstellbar auf 22 ± 1 °C);
5. Thermometer;
6. binokulares Präpariermikroskop;
7. Digitalkamera (mit einer Auflösung von mindestens 4 Megapixeln und mit Mikroskopfunktion);
8. Software zur Bilddigitalisierung
9. Petrischale (z.B. 100 × 15 mm) oder transparente Kulturschalen aus Kunststoff in vergleichbarer Größe;
10. Analysewaage mit einer Messgenauigkeit von 3 Dezimalstellen (mg);
11. Oxi-Meter (zur Messung des gelösten Sauerstoffs);
12. pH-Messgerät;
13. Gerät zur Messung der Lichtintensität (Anzeige in lx);
14. verschiedene Labor-Glasgeräte und -Werkzeuge;
15. einstellbare Pipetten (10-5.000 µl) oder Pipettensortiment in entsprechenden Größen;
16. Prüfchemikalie in hinreichenden Mengen zur Durchführung des Tests, vorzugsweise aus einer Charge;
17. Analysegeräte zur Untersuchung der zu prüfenden Chemikalien bzw. ein entsprechender Analyse- Dienstleister.

Prüfbarkeit der Chemikalie

6. Der AMa beruht auf einem Protokoll zur Exposition in Wasser, bei dem die Prüfchemikalie über ein Durchflusssystem in die Becken geleitet wird. Mit Durchflusssystemen sind jedoch Einschränkungen hinsichtlich der Chemikalientypen verbunden, die geprüft werden können. Maßgeblich sind die jeweiligen physikalischen und chemischen Eigenschaften der Chemikalie. Vor der Anwendung dieses Protokolls sind daher grundlegende Informationen zur jeweiligen Chemikalie zu beschaffen, die für die Durchführbarkeit des Tests von Bedeutung sind. Außerdem ist das OECD