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Die Technischen Regeln für Biologische Arbeitsstoffe (TRBA) geben den Stand der sicherheitstechnischen, arbeitsmedizinischen, hygienischen sowie arbeitswissenschaftlichen Anforderungen bei Tätigkeiten mit Biologischen Arbeitsstoffen wieder. Sie werden vom

Ausschuss für Biologische Arbeitsstoffe (ABAS)

aufgestellt und von ihm der Entwicklung entsprechend angepasst. Die TRBa werden vom Bundesministerium für Arbeit und Sozialordnung im Bundesarbeitsblatt bekanntgegeben.

1 Anwendungsbereich

Mit diesem Verfahren wird die über die Probenahmedauer gemittelte Konzentration an vermehrungsfähigen Schimmelpilzen personengetragen oder ortsfest in der Luft im Arbeitsbereich ermittelt. Schimmelpilze können sowohl in Form von Sporen (Konidien) als auch in Form von Myzelfragmenten in der Luft vorkommen (Verbreitungseinheiten). Das Verfahren beruht auf der Abscheidung auf einem Membranfilter mit anschließender Bestimmung durch Kultivierung.

2 Begriffsbestimmungen, Erläuterungen

2.1 Konzentration

Die Konzentration von Schimmelpilzen in der Luft wird bei kultivierungsabhängigen Verfahren als die Anzahl Kolonie bildender Einheiten (KBE) pro m³ Luft angegeben.

2.2 Kultivierung, Direkte Methode

Die beaufschlagten Membranfilter werden direkt auf die Nährböden gelegt, bebrütet und ausgezählt.

2.3 Kultivierung, Indirekte Methode

Die auf den Membranfiltern befindlichen Schimmelpilze werden zunächst in Lösung gebracht und nach Anlegen einer Verdünnungsreihe auf Nährböden ausgespatelt. Anschließend folgt die Bebrütung und die Auszahlung der Kolonie bildenden Einheiten.

3 Allgemeines

(1) Schimmelpilze gehören zu den eukaryontischen Mikroorganismen. Unter dem Begriff Schimmelpilze fasst man im Sprachgebrauch Fadenpilze aus mehreren taxonomischen Gruppen zusammen: Zygomycetes, Ascomycetes, Fungi imperfecti. Sie kommen ubiquitär in der Natur vor und erfüllen im Stoffkreislauf der Natur bei der Mineralisation der organischen Substanz eine wichtige Funktion. Daneben besitzen einige Pilzarten eine pathogene Wirkung auf Lebewesen. Aufgrund der Fähigkeit, organisches Material zersetzen zu können, kommen viele Schimmelpilze auch in der direkten Umgebung des Menschen vor.

(2) Dies gilt auch für verschiedene Arbeitsbereiche des Menschen, in denen bisweilen hohe Konzentrationen an Schimmelpilzen in der Luft angetroffen werden können, die zum Teil sehr deutlich über den Hintergrundwerten in der Außenluft liegen können. Solche Arbeitsbereiche finden sich z.B. in der Landwirtschaft, bei der Holzverarbeitung und in der Abfallwirtschaft. Schimmelpilze können aber auch - bei geeigneter Feuchte der Luft oder des Substrates - im Innenraumbereich von Gebäuden vorkommen (z.B. Wände, Teppiche, Raumlufttechnische Anlagen).

(3) Die Verbreitungseinheiten der Schimmelpilze in der Luft können einzelne Sporen (Konidien), Aggregate von Sporen, sowie größere und kleinere Hyphenbruchstücke sein, die meist frei oder an Staubpartikel gebunden bzw. in Tröpfchen suspendiert vorkommen können. Die Durchmesser der Sporen sind von Art zu Art unterschiedlich, betragen bei den meisten luftgetragenen Arten 2-10 µm, in wenigen Fällen bis 30 µm (geometrischer Durchmesser). Hyphenbruchstücke sind bis 10 µm breit, können jedoch deutlich länger als 30 µm sein.

(4) Grundsätzlich sind alle Maßnahmen, die im Zusammenhang mit der Qualitätssicherung einhergehen und durch die Vorgaben der Guten Mikrobiologischen Technik (GMT) festgelegt sind, durchzuführen (vgl. TRBa 100).

(5) Der Einsatz von unterschiedlichen Verfahren zur Messung luftgetragener biologischer Arbeitsstoffe kann zu nennenswerten Schwankungen in den Ergebnissen führen. Große Bedeutung kommt ferner der Beschaffenheit des Probenahmegerätes (in Bezug auf die Abscheideleistung verschiedener Partikelgrößen), der Wahl des Probenahmeortes sowie dem Zeitpunkt und der Dauer der Messung zu. Die Aussagekraft von Messverfahren wird mit der Durchführung von Ringversuchen, in denen deren Genauigkeit, etwaige Schwachpunkte und Hinweise für die Weiterentwicklung ermittelt werden, verbessert.

(6) Das hier beschriebene Filtrationsverfahren ist eines von mehreren Verfahren, um luftgetragene Schimmelpilze zu bestimmen. Die Bestimmung der einatembaren Fraktion, das personengetragene Probenahmesystem, die quantitative Erfassung auch von Schimmelpilzkonzentrationen größer 10⁴ KBE/m³ Luft und die variable Aufarbeitung der beaufschlagten Filter (direkt, indirekt) stellen Vorteile gegenüber anderen Probenahmeverfahren dar. Auch wegen der Möglichkeit langer Probenahmezeiten ist das Filtrationsverfahren besonders zur Bestimmung luftgetragener Schimmelpilze geeignet. Jedoch ist es in Abhängigkeit von der Messaufgabe u. U. möglich, andere Verfahren, wie z.B. das Impingement oder die Impaktion für die Messung luftgetragener Schimmelpilze einzusetzen. Der Anwender hat die Eigenschaften der unterschiedlichen Verfahren, die sich, wie aus Vergleichsmessungen hervorgeht, auch in unterschiedlichen Messwerten derselben Probe niederschlagen können, zu berücksichtigen und deren Anwendbarkeit zu begründen. Eine Hilfestellung gibt [1].

4 Probenahme

4.1 Messprinzip

Mit Hilfe einer im Sammelgerät integrierten oder an einem Probenahmekopf angeschlossenen Pumpe wird ein definiertes Luftvolumen durch einen Membranfilter gesaugt, die Verbreitungseinheiten der Schimmelpilze werden auf dem Filter abgeschieden.

4.2 Probenahmegeräte

(1) Die Probenahmegeräte müssen für die besonderen Bedingungen der Probenahme biologischer Aerosole geeignet sein (z.B. Sterilisierbarkeit, Handhabung).

(2) Für die Sammlung von Schimmelpilzen in der Luft stehen neben den im Arbeitsschutz etablierten Staubprobenahmegeräten auch spezielle Luftkeimsammelgeräte nach dem Filtrationsprinzip zur Verfügung.

(3) Der Einsatz von Probenahmegeräten, die Partikel gemäß der in der DIN EN 481 "Festlegung der Teilchengrößenverteilung zur Messung luftgetragener Partikel" niedergelegten Charakteristik erfassen (einatembarer Anteil), wird insbesondere für personengetragene Probenahmegeräte als erstrebenswert angesehen, ist aber nicht Voraussetzung. In jedem Fall muss die Abscheideleistung definiert sein. Für Geräte, die nicht geprüft sind, müssen durch den Hersteller entsprechende Vorgaben für die Anwendung gegeben werden.

4.3 Ausrüstung

4.3.1 Beispiele für Probenahmesysteme

Darüber hinaus können weitere Probenahmesysteme, die von einer Prüfstelle für Mess-, Prüf- und Probenahmegeräte zur Feststellung einer Gesundheitsgefährdung am Arbeitsplatz als geeignet festgestellt wurden, verwendet werden.

4.3.2 Beispiele für Filter

Der Durchmesser richtet sich nach Größe des Sammelkopfes, typischerweise 37 mm oder 80 mm,

• Gelatinemembranfilter (3 µm Porengröße)
• Zellulosenitratmembranfilter (0,8 µm Porengröße)
• Zelluloseacetatmembranfilter (0,8 µm Porengröße)
• Polycarbonatmembranfilter (0,8 µm Porengröße).

4.3.3 Weitere Messgeräte (nach Bedarf)

• Luftfeuchtemesser
• Thermometer
• Anemometer.

4.3.4 Weiteres Material (nach Bedarf)

Desinfektionsmittel, Ethanol, Hydrophile Watte, Einmalhandschuhe, Geräte für Materialprobenahme, Sterilbehälter, Schreibmaterial, Probenkühler.

4.4 Probentransport

Beim Transport sollen die beaufschlagten Filter in sicheren Behältnissen, vor widrigen Einflüssen weitgehend geschützt, aufbewahrt und möglichst rasch ins Laboratorium zur Analyse gebracht werden, das bedeutet in der Regel am Tage der Probenahme. Sollte dies aus bestimmten Gründen nicht möglich sein (z.B. Versand per Post, Probenahme am Wochenende), ist die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Schimmelpilze sowie die Verhinderung des Pilzwachstums auf den beaufschlagten Filtern durch Kontrolle der Umgebungsparameter sicherzustellen. Die mit Schimmelpilzen beaufschlagten Filter sollen bis zur weiteren Verarbeitung im Labor trocken (<60 % rel. Feuchte) bei Umgebungstemperatur transportiert und gelagert werden. Dabei soll die Umgebungstemperatur nicht höher als die spätere Bebrütungstemperatur sein. Widrige Einflüsse sind z.B. Sonnenlicht, übermäßige Feuchte, Hitze, Erschütterungen.

5 Analyse

5.1 Allgemeine Hinweise

(1) Grundlage der Analyse ist die Kultivierung der lebens- und vermehrungsfähigen Schimmelpilze auf einem geeigneten Nährboden. Diese müssen vielen verschiedenen Arten von Schimmelpilzen ein Wachstum ermöglichen. Eine Aussage über nicht vermehrungsfähige Verbreitungseinheiten ist nicht möglich. Die Bestimmung der Koloniezahl erfolgt visuell (Stereomikroskop) oder unter Zuhilfenahme anderer für die Auszählung geeigneter Geräte (z.B. Koloniezählgeräte).

(2) Die Auszählbarkeit der Kolonien muss stets gewährt sein. Dies ist insbesondere bei Schimmelpilzen wichtig, da sie größere Kolonien bilden als Bakterien.

(3) In zweifelhaften Fällen kann eine nähere Untersuchung einzelner Kolonien auf einem Objektträger unter einem Mikroskop für eine Differenzierung der Schimmelpilze von Actinomyceten und anderen Bakterien notwendig sein. Zum Zwecke der weitergehenden Identifizierung von Fadenpilzen ist eine Überimpfung einzelner Kolonien auf frische Nährböden notwendig. Die Animpfung muss nach dem international anerkanntem Verfahren der 3-Punkt-Methode auf Nährmedien erfolgen, die zur Identifizierung der entsprechenden Taxa in anerkannter Literatur beschrieben wurden.

(4) Die Bewertung der erhaltenen Ergebnisse muss immer unter Berücksichtigung parallel genommener Hintergrundwerte (Außenluft) erfolgen, um das Messverfahren zu überprüfen (vgl. TRBa 405, Ermittlung der Hintergrundbelastung). Kontrollen sind stets mitzuführen.

5.2 Direkte Methode

5.2.1 Grundlagen, Nachweisgrenzen

Die praktische und schnelle Methode der Kultivierung von Proben luftgetragener Schimmelpilze durch direktes Auflegen der beaufschlagten Filter hat ihre Begrenzung vor allem dann, wenn hohe Konzentrationen gemessen werden sollen. Die Bestimmungsgrenze des Verfahrens hängt vom Volumenstrom des Probenahmegerätes und dem Durchmesser des beaufschlagten Filters ab. Die untere Bestimmungsgrenze lässt sich durch Verwendung einer hinreichend großen Durchflussrate oder durch Verlängerung der Probenahmedauer bis unter 10 KBE/m³ senken. Die obere im optimalen Bereich liegende Bestimmungsgrenze z.B. des Probenahmesystems PGP-GSP (3,5 l/ mm, 37 mm ∅ Filter) würde bei der minimalen Probenahmedauer von einer Minute bei 9000 KBE/m³ liegen, höhere Konzentrationen sind nicht mehr bestimmbar und für weitere Berechnungen nicht zu berücksichtigen. In diesem Fall ist der Einsatz der indirekten Methode notwendig. Die obere Bestimmungsgrenze der direkten Methode kann auch durch Einsatz von Probenahmesystemen mit einem reduzierten Durchsatz von z.B. 0,5 l/min nach oben verschoben werden. Hierfür wurde der Probenahmekopf des GSP-Systems entsprechend modifiziert und die Vergleichbarkeit mit dem GSP 3,5 l/min hinsichtlich der Erfassungscharakteristik nachgewiesen.

5.2.2 Geräte, Material (beispielhafte Auswahl)

• Autoklav für die Dampfsterilisation
• Brutschrank
• Stereomikroskop (Aufhebt - Durchlicht, Hellfeld - Dunkelfeld, Vergrößerung 2-40fach)
• Kühlschrank
• Bunsenbrenner
• Kleingeräte, wie z.B. Membranfilterpinzetten, Platinimpfösen, Impfnadeln, Kollehalter
• ggf. Sicherheitswerkbank
• Petrischalen, steril, aus Kunststoff oder Glas, Durchmesser je nach Filtergröße z.B.
• 85 mm (bei Eigenherstellung der Nährbödenplatten)
• Glasgeräte, z.B. Messpipetten, Erlenmeyerkolben, Bechergläser, Messzylinder, verschließbare
• Glasbehälter, Alufolie
• Laborwaagen, Magnetrührer

5.2.3 Chemikalien, Nährmedien und Lösungen

(1) Als Reagenzien werden, wenn nicht anders angegeben, solche des Reinheitsgrades "zur Analyse" eingesetzt. Als Wasser zum Ansetzen der wässrigen Lösungen und Nährböden wird aus einer Glasapparatur doppelt destilliertes Wasser oder Wasser mit vergleichbarer Qualität verwendet.

(2) Die Agarplatten mit den entsprechenden Nährböden können gebrauchsfertig im Fachhandel bezogen werden. Dabei sind, ebenso wie bei der Eigenherstellung der Platten, unbedingt die spezifischen Aufbewahrungszeiten der unterschiedlichen Nährböden entsprechend den Herstellerangaben einzuhalten, z.B. austrocknungsgeschützt bei 50 °C. Für die Bestimmung der KBE von Schimmelpilzen in der Luft am Arbeitsplatz wird DG-18-Agar empfohlen.

5.2.4 Dichloran-Glyzerin-(DG-18-)Agar

(1) Der DG-18-Agar ist ein Nährmedium zum selektiven Nachweis xerophiler d. h. die Trockenheit bevorzugender Schimmelpilze. Er wurde zur Koloniezahlbestimmung und Isolierung xerophiler Schimmelpilze aus (halb) getrockneten Lebensmitteln und in vielen Studien zur Bestimmung von Schimmelpilzgehalten erfolgreich eingesetzt. Chloramphenicol hemmt dabei das bakterielle Wachstum, insbesondere das von gramnegativen Bakterien. Glyzerin senkt die Wasseraktivität a0 auf 0,95 herab. Dichloran hemmt die Ausbreitung der Fadenpilze und verhindert ein Überwachsen langsamer wachsender Kolonien.

Anmerkung: Bei der Wahl des DG-18-Agars ist zu beachten, dass Vertreter der Zygomycetes deutlich unterrepräsentiert sind (überdurchschnittliche Hemmung durch Dichloran). Dies kann bei der quantitativen Erfassung von opportunistischen Erregern aus dieser Gruppe (z.B. Absidia corymbifera, Rhizopus spp.) von Bedeutung sein.

(2) Zusammensetzung des DG-18-Agars:

5.2.5 Durchführung

(1) Als Filter für die direkte Methode haben sich insbesondere Gelatinefilter als vorteilhaft erwiesen. Es können auch Polykarbonatmembranfilter oder Zellulosenitratmembranfilter verwendet werden. Die Probenahmedauer soll mindestens eine Minute betragen.

(2) Das mit den Schimmelpilzen beaufschlagte Filter wird mit einer Pinzette auf den vorbereiteten Nährboden in der Petrischale gelegt und mit dem Deckel verschlossen. Durch Teilung des beaufschlagten Filters können, eine homogene Verteilung der Schimmelpilze auf dem Filter vorausgesetzt, mehrere Platten belegt werden. Allerdings verringert sich in diesem Fall die statistische Aussagekraft. Der Austausch der Nährstoffe und Stoffwechselprodukte erfolgt durch das Porensystem des Membranfilters.

(3) Die Bebrütung der mit den Filtern belegten Agarplatten erfolgt in einem Brutschrank bei 25 °C ± 10 für 7 Tage. Die erste Auszählung soll wegen der ggf. möglichen hohen Belegung bereits nach 24 h erfolgen und dann in Tages-/Zweitagesabständen bis zum einschließlich 7. Tag. Für die Beurteilung des Messergebnisses ist ausschlaggebend die Angabe des Wertes mit der höchsten Koloniezahl, der sich bei den Auszählungen bis zum einschließlich 7. Tag ergab. Eine Überbelegung des Filters ist durch Festlegung der Probenahmebedingungen zu vermeiden.

(4) Der optimale Auswertungsbereich z.B. eines 37 mm ∅ Membranfilters liegt zwischen 3 - 30 gewachsenen Schimmelpilzkolonien. Grundsätzlich ist im Protokoll (vgl. TRBa 405) die Zahl der tatsächlich ausgezählten Kolonien und die auf den Kubikmeter Luft bezogene Koloniezahl anzugeben. Liegt - bei gleichzeitig niedrigem Probenahmevolumen - nur eine sehr geringe Anzahl (unter 5) Kolonien vor, ist die mögliche Schwankungsbreite des Ergebnisses größer. Bei mehr als 30 Kolonien kann das Ergebnis nur zur Orientierung herangezogen werden, da wegen der dichten Belegung des Filters höchstwahrscheinlich eine Unterdrückung weiteren Kolonienwachstums stattgefunden hat. Besitzt der Filter einen größeren Durchmesser, verschiebt sich die obere Grenze des optimalen Auswertungsbereiches entsprechend nach oben.

(5) Für die Auszahlung von unlöslichen Membranfiltern (Zelluloseester) bietet sich die Verwendung grauer Filter (mit Gitternetz) an, da viele Pilze hellfarbige Kolonien bilden. Um die ggf. mikroskopisch sichtbaren Schimmelpilzkolonien zweifelsfrei als solche identifizieren zu können (Koloniemorphologie, Sporen) kann sich eine Auszahlung unter einem Stereomikroskop bzw. mit Hilfe anderer geeigneter Geräte anbieten.

(6) Nach Auszählung der gewachsenen Kolonien pro Platte wird das Ergebnis in koloniebildenden Einheiten pro m³ Luft gemäß folgender Formel berechnet:

5.3 Indirekte Methode

5.3.1 Grundlagen, Nachweisgrenzen

(1) Die Methode des Lösens der Schimmelpilze von den Filtern mit nachfolgendem Anlegen einer dezimalen Verdünnungsreihe erlaubt die Erfassung stark unterschiedlicher Schimmelpilz-Konzentrationen in der Luft. Daneben ist - für die Qualitätssicherung wichtig - das Beimpfen von Parallelplatten möglich. Darüber hinaus ist ggf. das Animpfen unterschiedlicher Nährböden mit Aliquots derselben Proben möglich, um vergleichende Untersuchungen vornehmen zu können.

(2) Beim Ablösen der Verbreitungseinheiten von den Membranfiltern und Anlegen der Verdünnungsreihe können Aggregate, etwa von Pilzsporen bzw. Ansammlungen an Partikeln, aufgelöst werden und so zu höheren Koloniezahlen führen. Ein 3-Sporen-Aggregat kann bei dieser Methode u. U. drei Kolonien ergeben, während sich bei der direkten Methode daraus eine auszählbare Kolonie entwickeln würde.

(3) Im Gegensatz dazu kann es durch eine nicht vollständige Ablösung von den beaufschlagten Filtern oder durch eine Schädigung der Schimmelpilze bei der weiteren Aufarbeitung im Labor zu einer Verminderung der Koloniezahl kommen.

(4) Da durch das Verbringen der beaufschlagten Filter in physiologische Kochsalzlösung (z.B. 10 ml) sofort ein Verdünnungsfaktor in die Berechnung eingeführt wird, ist dies bei der Entscheidung für diese Methode zu berücksichtigen, und insbesondere bei niedrigeren Schimmelpilzgehalten der Luft (<10⁴ KBE/m³) ist dieser Tatsache etwa durch eine längere Probenahme entsprechend Rechnung zu tragen. Die untere Bestimmungsgrenze hängt vom Volumenstrom des eingesetzten Probenahmegerätes und der gewählten Probenahmedauer ab. Die Indirekte Methode ist insbesondere auch für längere Probenahmezeiten im Stundenbereich prädestiniert, zumal die Schimmelpilzsporen eine hohe Austrocknungstoleranz besitzen. Die obere Bestimmungsgrenze ist durch das Anlegen der Verdünnungsreihe offen.

5.3.2 Geräte, Material

Neben den in Nummer 5.2.2 genannten Geräten und Materialen werden benötigt:

• Whirlmixer, Reagenzglasmixer, Schüttler, Schüttelwasserbad oder ähnliches
• Drigalski-Spatel, Drehtisch
• geeignetes Glasgerät für das Schütteln des Filters und Herstellen der Verdünnungsreihe, z.B. Erlenmeyerkolben, Glasflaschen, Messpipetten.

5.3.3 Chemikalien, Nährmedien und Lösungen

Es werden die unter Nummer 5.2.3 und Nummer 5.2.4 beschriebenen Chemikalien, Nährmedien und Lösungen verwendet. Für die Stammlösung und die Verdünnungsreihe ist darüber hinaus die Herstellung einer physiologischen Kochsalzlösung (0,9 %ige Sahne) mit 0,01 % Tween 80, erforderlich.

5.3.4 Durchführung

(1) Als Filter für die indirekte Methode haben sich insbesondere Polykarbonat- und Gelatinefilter bewährt. Zelluloseester dürfen für die Indirekte Methode nicht eingesetzt werden. Bei der indirekten Methode kann die Probenahmedauer wegen der großen Austrocknungstoleranz der Schimmelpilze auch im Stundenbereich liegen.

(2) Das mit den Verbreitungseinheiten beaufschlagte Filter wird mit einer sterilen Pinzette in 10 ml physiologische Kochsalzlösung (0,9 %ige NaCl mit 0,01 % Tween 80) verbracht. Wird das Filter in ein anderes Volumen der Kochsalzlösung eingebracht, so ist dies bei der Berechnung des Ergebnisses entsprechend zu berücksichtigen. Die Filter sollen in der Stammlösung bei 35 - 40 °C für 15 min im Schüttler geschüttelt und für 4 min intensiv "gevortext"⁴⁾ werden. Auf eine quantitative Ablösung der Schimmelpilze von den Filtern - bei Erhaltung der Wachstumsfähigkeit - ist zu achten. Die Aufarbeitung der Filter soll innerhalb von zwei Stunden nach Verbringung in die Stammlösung erfolgen.

(3) Ausgehend von dieser Ursprungssuspension legt man eine serielle Verdünnungsreihe an. Hierfür entnimmt man 1 ml der Suspension und pipettiert diesen, unter guter Durchmischung, zu jeweils 9 ml Verdünnungsflüssigkeit (0,9 %ige Sahne mit 0,01 % Tween 80). Mit dieser ersten Verdünnungsstufe verführt man in gleicher Weise. Ausgehend von der Ursprungssuspension (1:1) kommt man (unter Pipettenwechsel) damit zu Dezimalverdünnungen (1:10, 1:100, 1:1000, etc.). Der Grad der Verdünnung richtet sich nach der zu erwartenden Zahl Kolonie bildender Einheiten.

(4) Anschließend werden, ausgehend von der höchsten Verdünnungsstufe, je 0,1 ml der jeweiligen Stufe (1:1, 1:10, 1:100, etc.) auf mindestens je 3 Platten des ausgewählten Nährbodens mit einer Pipette gegeben und gemäß dem Spatelverfahren mit dem Drigalski-Spatel unter kreisenden Bewegungen der Platte ausgespatelt.

(5) Nach dem Ausspateln werden die Nährbodenplatten mit dem Boden nach oben in einem Brutschrank bei 25 °C ± 1 °C für 7 Tage bebrütet. Die erste Auszählung soll nach 48 h erfolgen und dann in Ein- oder Zweitagesabständen bis zum einschließlich 7. Tag, wobei letztlich die maximal gezählte Koloniezahl innerhalb dieser 7 Tage für jede Verdünnungsstufe angegeben wird.

(6) Nach Auszählung der gewachsenen Kolonien erfolgt zunächst die Berechnung des Koloniemittelwertes 8 der Verdünnungsstufe mit den auswertbaren Koloniezahlen. Der optimale Auswertungsbereich einer 85 mm ∅ Nährbodenplatte beträgt 10 - 100 gewachsene Schimmelpilzkolonien, der zugehörige Toleranzbereich 5 - 150 gewachsene Kolonien, bei zu berücksichtigender Priorität der jeweils benachbarten Verdünnungsstufe.

(7) Anschließend wird der Mittelwert 5 der gewachsenen Kolonien der für die Auswertung herangezogenen Verdünnungsstufe mit dem Verdünnungsfaktor d dieser Verdünnungsstufe multipliziert (z.B. bei 10.2 ist d = 100) sowie dem Faktor 100, der sich daraus ergibt, dass nur 0,1 ml von 10 ml der Suspension ausgespatelt wurden. Besitzt die Ursprungssuspension ein anderes Volumen, ist dies bei der Berechnung entsprechend zu berücksichtigen. Der resultierende Wert G ist die Zahl der im genommenen Probenahmevolumen vorhandenen und dann in 10 ml suspendierten (= Ursprungssuspension) Verbreitungseinheiten:

G = 8 ⋅ d ⋅ 100

Die Berechnung des Ergebnisses in koloniebildenden Einheiten pro m³ Luft (= KBE/m³ Luft) erfolgt dann gemäß folgender Formel:

5.4 Schwankungsbreite

Die Genauigkeit von mikrobiologischen Verfahren zur Bestimmung der Schimmelpilze in der Luft ist aus prinzipiellen Gründen begrenzt (vgl. Nummer 3(5)). Für die Interpretation von Messergebnissen ist es daher erforderlich, Aussagen zur Schwankungsbreite der ermittelten Schimmelpilzkonzentrationen zu berücksichtigen. Hierzu werden die Ergebnisse aus Ringversuchen herangezogen, die u. a. Aussagen zur erreichten relativen Standardabweichung ermöglichen. In Bezug auf das hier beschriebene Verfahren leitet sich die durchschnittliche relative Standardabweichung (rel. S) wie folgt her:

• 1. Ringversuch [2] (gleichzeitige Probenahme vor Ort und Auswertung durch acht verschiedene Labore):
  rel. S (Polycarbonatfilter) 38 %, 31 %, 41 %
• 
  Versuch mit einheitlich beaufschlagten Filtern und Auswertung in einem Labor [3]:
  rel. S (Gelatinefilter) 25 %, 18 %, 21 %
  rel. S (Polycarbonatfilter) 22 %
• 
  2. Ringversuch [4] (einheitlich? beaufschlagte Filter unterschiedlicher Konzentration, je vierzehn verschiedene Labore):
  rel. S (Gelatinefilter) 28 %, 22 %, 33 %, 17 %, 16 %, 23 %
  rel. S (Polycarbonatfilter) 46 %, 50 %, 47 %, 39 %, 31 %, 34 %

Da die verschiedenen Filtermaterialien auch für unterschiedliche Aufarbeitungsmethoden stehen, wird die Standardabweichung in Bezug auf das Filtermaterial angegeben und das Vertrauensintervall entsprechend berechnet. Aus den Versuchen folgt:

rel. S (Gelatinefilter) durchschnittlich 23 %

rel. S (Polycarbonatfilter) durchschnittlich 38 %

Weiterhin spielt die Festlegung der Messstrategie für die Aussagekraft der Messwerte eine wichtige Rolle [5].

5.5 Spezielle Analysebedingungen

Die Anzucht auf DG 18-Agar bei 25 °C Bebrütungstemperatur dient der routinemäßigen Analyse der mesophilen Schimmelpilze. Die hier aufgeführte Liste gibt dem Anwender Hilfestellung, wenn die Fragestellung der Untersuchung zusätzlich andere Analysebedingungen erfordert, z.B. bei der Untersuchung einzelner thermotoleranter, humanpathogener Spezies.

Tabelle: Wachstumstemperaturen ausgewählter Schimmelpilzarten

Als wichtigste Bebrütungstemperaturen werden 25 °C (Standardtemperatur für die mesophilen Schimmelpilze, darunter die meisten allergologisch und ein Großteil der toxikologisch bedeutsamen Arten) und gegebenenfalls 37 °C (für die thermotoleranten, humanpathogenen Arten, insbesondere mit infektiologischer Bedeutung, z.B. Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger) empfohlen. Falls man einen besonderen Wachstumsvorteil für Aspergillus fumigatus wünscht, können 40 - 43 °C Bebrütungstemperatur gewählt werden. Einige Lebensmittelverderber sind in der Lage, auch bei Temperaturen unter dem Gefrierpunkt noch zu wachsen. Thermophilie findet sich unter den Schimmelpilzen nur selten (z.B. der auf Brot vorkommende Mucorpusillus mit einem Optimum bei 35 - 55 °C und einem Maximum bei 55 - 60 °C. Als primäres Nährmedium für die Quantifizierung wird der DG 18-Agar empfohlen. Für die Artendifferenzierung existieren je nach Fragestellung verschiedene Spezialnährböden, deren Einsatz mit einem in der Differenzierung erfahrenen Labor individuell abgestimmt werden sollte.

Literatur

[1] N. N. Benutzerhinweise für die Auswahl von Messverfahren für biologische Arbeitsstoff BIA-Arbeitsmappe

[2] Averdiek, B., et al. 1997. Bestimmung der Konzentration Biologischer Arbeitsstoffe in der Luft am Arbeitsplatz. Erster Ringversuch "Schimmelpilze". Gefahrstoffe - Reinhaltung der Luft. 57: 129-136.

[3] Rabe, R. und N. Wagner. 2000. Herstellung von standardisierten Prüfaerosolen mit Schimmelpilzsporen. Gefahrstoffe - Reinhaltung der Luft. 60: 407-411.

[4] Schreiben des Berufsgenossenschaftlichen Instituts für Arbeitssicherheit (BIA) vom 07.02.2000 an die Teilnehmer: Ergebnismitteilung zum zweiten Ringversuch "Schimmelpilze" 1999.

[5] TRBa 405 "Anwendung von Messverfahren für luftgetragene Biologische Arbeitsstoffe. BArbBl. 5/2001, S. 58-61.

ENDE