1 Das Sindbis-Virus- und das Semliki-Forest-Virus-Expressionssystem

1.1 Allgemeine Einführung SIN und SFV

Das Sindbis-Virus (SIN) sowie das Semliki-Forest-Virus (SFV) gehören zur Familie der Togaviridae, Genus Alphavirus. Sie verfügen über ein ikosaedrisches Nukleokapsid, welches eine einzelsträngige lineare RNA positiver Polarität als Genom enthält und welches von einer Lipid-Hülle umgeben ist, in der virale Hüllproteine eingebettet sind. Die Viren sind weit verbreitet und werden von Mücken übertragen, SIN von der Gattung Aedes, SFV von der Gattung Culex. SIN kann beim Menschen eine fieberhafte Erkrankung mit Ausschlag und Arthritis hervorrufen, SFV kann beim Menschen ebenfalls eine fieberhafte Erkrankung hervorrufen [1, 2]. Das ursprüngliche SFV-Isolat L10 ist neurovirulent für Mäuse, das SFV-Isolat A7 hingegen ist avirulent [1, 21. Generell gelten diese Viren als schwach pathogen, aber es wurde auch von einem Todesfall berichtet, der durch eine Laborinfektion mit SFV verursacht wurde [3]. In vitro infizieren die Viren ein breites Wirtsspektrum, welches Zellen von Insekten, Vögeln und Säugern umfasst. Vertebratenzellen werden lytisch infiziert, in Insektenzellen verläuft die Infektion in der Regel persistent [1]. Gemäß Bekanntmachung nach § 5 Absatz 6 GenTSV sind SIN und SFV der Risikogruppe 2 zugeordnet.

Bei den viralen Genomen handelt es sich um (+)-Strang-RNA. Sie weisen am 5'-Ende eine CAP-Struktur auf, sind am 3'-Ende polyadenyliert und haben ohne die terminalen Strukturen eine Länge von 11703 nt (49S RNA) bei SIN und 11442 nt (42S RNA) bei SFV. Die genomischen RNAs enthalten zwei offene Leserahmen, einen für die Nichtstrukturproteine und einen für die Strukturproteine. An den Termini sowie zwischen den beiden Leserahmen befinden sich untranslatierte Nukleotidsequenzen (UT), die für die Replikation und Translation essenziell sind. Das Verpackungssignal ψ liegt innerhalb des Leserahmens der Nichtstrukturproteine (Abb. 1) [1, 4, 5]. Zwischen den beiden Leserahmen befindet sich der interne Promotor (subgenomischer Promotor, P_sg oder 26SPromotor) der (-)-Strang-RNA.

Abbildung 1: Genomkarte von SIN und SFV

m⁷GpppA: Cap-Struktur; ψ: Verpackungssignal; nsP1-nsP4: Nichtstrukturproteine;

P_sg: Lage des subgenomischen Promotors; C: Kapsidprotein; E1, E2, E3, 6K: Glykoproteine; Poly(A): Polyadenylierung; UT: untranslatierte Region.

SIN- und SFV-Replikationszyklus

Nach Infektion einer Zelle dient das virale Genom .direkt als mRNA. Von ihr werden zuerst die viralen Nichtstrukturproteine nsP1-4 als Polyprotein translatiert, welches über die Proteaseaktivität von nsP2 zu den einzelnen Nichtstrukturproteinen nsP1, nsP2, nsP3 und nsP4 prozessiert wird, die dann zur Replikase aggregieren und das Genom in komplementäre (-)-Strang-RNA umschreiben. Die Nichtstrukturproteine zeigen folgende Funktionen: Methyltransferase bei nsP1, Protease bei nsP2, nsP3 ist ein Phosphoprotein mit noch ungeklärter Funktion und nsP4 wahrscheinlich die Polymerase. Der (-)-Strang dient als Template für die Herstellung genomischer "full-length" RNA sowie über den internen subgenomischen Promotor auch für die Herstellung der subgenomischen 26S RNA, die ebenfalls mit CAP-Struktur und Polyadenylierung versehen wird [1].

Auch die subgenomische RNA wird zunächst in ein Polyprotein translatiert, welches nach Proteolyse schließlich zum Kapsidprotein C, den Glykoproteinen El, E2 und E3 sowie dem Protein 6K prozessiert wird. C ist eine Autoprotease, die sich selbst vom Rest der Strukturproteine abspaltet und das Verpackungssignal Ni, welches auf dem SIN-Genom innerhalb des nsP1-Leserahmens [4] und auf dem SFV-Genom innerhalb des nsP2-Leserahmens [5] liegt, erkennt und über diese Bindung genomische RNA zum Nukleokapsid verpackt. E3 ist ein Leader-Protein und bleibt mit E2 zunächst als Vorläuferprotein (PE2 oder p62) verbunden, das erst beim Zusammenbau des neuen Viruspartikels von einer zellulären Protease intrazellulär gespalten wird. Im Gegensatz zu SFV wird in der viralen Hülle von SIN kein E3 gefunden, jedoch sind beide Viren in der Lage, auch das ungespaltene Vorläuferprotein in die Virushülle einzubauen, seine proteolytische Spaltung ist aber Voraussetzung für die weitere Infektiosität [6, 7]. E2 interagiert beim viralen Zusammenbau mit dem Nukleokapsid und bildet zusammen mit El Heterodimere aus, wovon jeweils drei einen "Spike" in der viralen Hülle formen. 6K ist ein Leader-Protein und für den Zusammenbau des Viruspartikels von Bedeutung. E1 ist zu Beginn der Infektion für die Fusion der viralen Membran mit der Wirtszellmembran verantwortlich [1].

Die Replikation der viralen RNAs findet im Zytoplasma statt. Die neuen Viruspartikel werden von der infizierten Zelle durch Knospung abgegeben [1].

1.2 Gentransfer mithilfe SIN- und SFV-abgeleiteter Vektoren

Grundsätzlich werden drei Typen von SIN- oder SFV-abgeleiteten Vektor-Systemen unterschieden.

• Die Vektoren verfügen lediglich über cis-regulatorische Nukleotid-Sequenzen für die Replikation sowie einen Promotor für die Expression des heterologen Gens. Sie benötigen über eine Helferfunktion die Nichtstrukturproteine für die Replikation der RNA und die Expression des heterologen Gens sowie die Strukturproteine zur Erzeugung viraler Partikel.
• Die Doppelpromotor-Vektoren enthalten neben dem Leserahmen für die Nichtstrukturproteine sowohl den Leserahmen der Strukturproteine als auch eine Insertionsstelle für ein heterologes Gen. Sowohl die späten Gene als auch das heterologe Gen stehen jeweils unter Kontrolle eines subgenomischen Promotors. Diese Vektoren sind replikationskompetent und können neu hergestellte RNA zu Viruspartikeln verpacken.
• Bei der dritten Gruppe von Vektoren wird vom ursprünglichen viralen Genom der Leserahmen der Strukturproteine durch das heterologe Gen ersetzt, wodurch sich das verbleibende rekombinante RNA-Genom mit dem Leserahmen der Nichtstrukturproteine zwar noch replizieren kann, es werden aber keine neuen viralen Partikel ausgebildet. Solche Replikons können entweder als in vitro hergestellte, reine RNA direkt auf Zellen übertragen werden, oder - wenn sie als cDNA übertragen werden und unter Kontrolle eines Polymerase II-Promotors stehen - erst in der Zelle transkribiert werden. Werden die viralen Strukturproteine über eine Helferfunktion zur Verfügung gestellt, wird das Replikon verpackt und virale Vektorpartikel ausgebildet.

DA der dritten Gruppe von Vektoren die größte Bedeutung zukommt, wird im Rahmen dieser allgemeinen Stellungnahme lediglich auf diese Gruppe von Vektoren im Detail eingegangen.

Erzeugung viraler Vektorpartikel

Typischerweise wird zur Herstellung solcher viraler Vektorpartikel zunächst der Leserahmen der viralen Nichtstrukturproteine als cDNA unter Kontrolle eines Promotors des Bakteriophagen SP6 gestellt und in ein pUC-abgeleitetes Plasmid inseriert (Abb. 2). Neben dem Leserahmen der Nichtstrukturproteine sind noch die viralen cis-regulatorischen Elemente, die für die Replikation und Translation benötigt werden, sowie der virale subgenomische Promotor, gefolgt von einer Insertionsstelle für das heterologe Gen als cDNA vorhanden. Im Anschluss an die virale cDNA liegt eine Restriktionsschnittstelle zur Linearisierung des Plasmidkonstruktes vor. Mithilfe der SP6-Polymerase wird in vitro Vektor-RNA (Replikon und Transgen) erzeugt, die in eine Wirtszelle transfiziert wird, wo die Nichtstrukturproteine und das heterologe Protein gebildet werden. Die Nichtstrukturproteine replizieren die Vektor-RNA und die subgenomische RNA. Zur Verpackung der Vektor-RNA zu viralen Vektorpartikeln müssen Strukturproteine über eine Helferfunktion zur Verfügung gestellt werden. Dies erfolgt in der Regel über kotransfizierte Helfer-RNA, von der die Strukturproteine translatiert werden. Die Helfer-RNA wird ebenfalls in vitro von einem linearisierten Plasmid, in dem die cDNA des Leserahmens der Strukturproteine unter Kontrolle des SP6-Promotors vorliegt, transkribiert. Es stehen aber auch Helferzelllinien, die konstitutiv Strukturproteine exprimieren, zur Verfügung [8]. Das Kapsidprotein erkennt das Verpackungssignal ψ auf der Vektor-RNA und bildet gemeinsam mit der Vektor-RNA das Nukleokapsid. An der Zytoplasmamembran wird das Nukleokapsid von einer Lipid-Membran, in welcher die Glykoproteine E2 und E3 als Spikes eingelagert sind, umhüllt und durch Knospung von der

Zelle abgegeben (Abb. 2). Sind die cis-regulatorischen Sequenzen gegenüber dem Wildtyp-Virus unverändert [9, 10] und werden Vertebratenzellen verwendet, kommt es nach wenigen Tagen zur Zytolyse.

Mit den replikationsdefekten viralen Vektorpartikeln können weitere Wirtszellen infiziert werden, um dort das heterologe Gen zu exprimieren. Neue Viruspartikel entstehen dann normalerweise nicht, da im Vektor keine Gene von Strukturproteinen vorhanden sind. Auch diese Wirtszelle stirbt nach wenigen Tagen ab, wenn die cis-regulatorischen Sequenzen im Vektor-Genom gegenüber dem Wildtyp-viralen Genom unverändert sind und wenn es sich bei der Wirtszelle um eine Vertebratenzelle handelt.

Prototyp-Plasmide

Prototyp-Plasmide, die cDNA des Replikons enthalten, sind pSINrep5 oder pSFV1-3, und Prototyp-Helferplasmide, die cDNA der Strukturproteine enthalten, sind pDH-BB ("defective helper") oder pSFV-Helperl [11, 12]. Diese Plasmide enthalten den SP6-Promotor zur in vitro Transkription der viralen Funktionen. Prototyp-Plasmide, die cDNA der Replikons unter Polymerase IIPromotor-Kontrolle enthalten, sind pDLTRSIN-β-gal oder pDCMVSIN-β-gal, Prototyp-Plasmide, die cDNA der Strukturproteine unter Polymerase II-Promotor-Kontrolle enthalten, sind pDLTR-dlnsPSIN oder pDCMV-dlnsPSIN [13].

Abbildung 2: Herstellung von SIN- und SFV-Vektorpartikeln

Im Vektorplasmid und im Helferplasmid liegen die viralen Leserahmen unter Kontrolle des SP6-Promotors (SP6) vor. In den Plasmiden liegen darüber hinaus die für die Replikation in E. coli K12 notwendigen Funktionen wie das Ampizillin-Resistenzgen und der bakterielle Replikationsursprung vor, sie werden in der Abbildung aber lediglich durch eine gestrichelte Linie angedeutet. Über eine Restriktionsschnittstelle (RS) werden die Plasmide linearisiert und anschließend mithilfe der SP6-Polymerase (SP6) in vitro transkribiert. Die in vitro transkribierten RNAs werden in eine eukaryote Zelle kotransfiziert, wo die Replikation der RNA und die Expression der viralen Proteine und des heterologen Proteins erfolgt. Die Vektor-RNA wird mithilfe der Strukturproteine zu replikationsdefekten viralen Vektorpartikeln verpackt.

Weitere Abkürzungen siehe Abb. 1.

1.3 Biologische Sicherheit der SIN- und SFV-abgeleiteten Vektoren

SIN- oder SFV-abgeleitete Vektoren zeichnen sich aufgrund des breiten Wirtsspektrums, der raschen Expression des übertragenen Gens sowie der hohen Expressionsrate aus. Darüber hinaus sind sie vorteilhaft, da sie sowohl sich teilende als auch ruhende Zellen infizieren und ihr RNA-Genom im Zytoplasma der Wirtszelle ohne DNA-Zwischenschritt replizieren. Trotz ihrer normalerweise kurzen Expressionsphase und ihrem zytolytischen Potenzial finden SIN- oder SFV-abgeleitete Vektoren sowohl in vitro als auch in vivo zahlreiche Möglichkeiten der Verwendung [13, 14, 15], weshalb der Sicherheit dieser Vektorsysteme besondere Aufmerksamkeit gewidmet wird.

Gestaltung der Helferplasmide

In der Regel werden replikationsdefekte SIN- oder SFV-abgeleitete Vektorpartikel hergestellt und verwendet. Bei diesen Vektoren ist der Replikationsdefekt eine sicherheitsrelevante Eigenschaft. So konzentrierten sich die ersten Untersuchungen auf die Möglichkeit einer Rekombination zwischen der transfizierten Vektor-RNA und der kotransfizierten Helfer-RNA, wobei gezeigt wurde, dass nach Kotransfektion verschiedener deletierter oder mutierter defekter SIN-RNAs, die der Vektor- und Helfer-RNA der SIN-Vektoren entsprechen, replikationskompetente Viren entstanden sind, deren RNA-Genom durch Rekombination zwischen den kotransfizierten RNAs entstanden ist und teilweise sogar länger als das des Wildtyps sein konnte [16].

Um die Entstehung infektiöser, replikationskompetenter Viren zu vermeiden, wurde in das SFV-abgeleitete Helferplasmid (pSFVHelperl, Abb. 3a) eine Dreifachmutation an der proteolytischen Spaltstelle von p62 eingeführt und damit erreicht, dass die entstehenden viralen Vektorpartikel ungespaltenes p62 in die Hülle einbauen und somit nicht infektiös sind (pSFV-Helper2, Abb. 3b). Erst durch eine Aktivierung mit a-Chymotrypsin werden die viralen Vektorpartikel in einen infektiösen Zustand überführt [17]. Hierdurch sollte verhindert werden, dass im Falle einer Rekombination zwischen den RNAs die entstehenden Viren infektiös sind und sich vermehren können. Jedoch wurden sowohl bei SFV- als auch bei SIN-Strukturproteinen mit Mutationen der proteolytischen Spaltstelle von p62 bzw. PE2 Suppressormutationen ("second site escape mutations") beobachtet [7, 18], die zu infektiösen Revertanten führten.

Suppressormutationen treten nur selten auf, ebenso sind Rekombinationen zwischen den kotransfizierten RNAs seltene Ereignisse, so dass die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten beider Ereignisse bei einem RNA-Molekül äußerst gering ist. Trotzdem führte die weitere Entwicklung der SFV-Helferplasmide schließlich zur Aufteilung der Leserahmen des Kapsidproteins und der Spike-Proteine E3-E2-6K-E1 auf zwei unabhängige Helfer-RNAs ("twohelper RNA system", Abb. 3c). Für eine effiziente Translation wurde der Translations-Enhancer (enh) vom Kapsidprotein vor die Spike-Proteine E3-E2-6K-E1 gestellt. Um ihn dann zur korrekten Bildung der Spike-Proteine wieder zu entfernen, wurde zwischen den Proteinen E3-E2-6K-E1 und dem Translationsenhancer die 2a Autoprotease des Maul- und Klauenseuche-Virus eingeführt (2A). In dem auf der zweiten RNA liegenden Leserahmen des Kapsidproteins wurde durch eine Mutation (stop) die Autoprotease-Aktivität des Kapsidproteins ausgeschaltet, wodurch eine weitere Verbesserung der Sicherheit erzielt wird [19]. Bei den so erzeugten viralen Vektorpartikeln ist nicht von einer Rekombination zwischen den RNAs zu vollständiger infektiöser RNA auszugehen.

Abbildung 3: Entwicklung von SFV-abgeleiteten Helferplasmiden

a) Das Helferplasmid enthält die Wildtyp-Strukturproteingene (pSFV-Helperl).

b) Im Helferplasmid sind die drei Arginin-Reste an der proteolytische Spaltstelle von p62 mutiert (SQL) (pSFV-Helper2).

c) Die Gene der Strukturproteine C und E3-E2-6K-E1 liegen auf zwei unabhängigen Helfer-Genomen vor ("two-helper-system").
stop: Mutation im Kapsidgen;
enh: Translationsenhancer des Kapsidproteins; 2A: 2a Autoprotease des Maul- und Klauenseuche-Virus.

Weitere Abkürzungen siehe Abbildungen 1 und 2.

Kapsid-unabhängige Verpackung des Replikons durch virale Hüllproteine

Der erste Schritt bei der Bildung umhüllter RNA-Viren und davon abgeleiteter Vektorpartikel ist die intrazelluläre Zusammenlagerung von genomischer RNA oder Vektor-RNA und den Kapsidproteinen zum Nukleokapsid. Dieser Vorgang wird über das Verpackungssignal ihr auf der RNA vermittelt. Erst über eine Wechselwirkung zwischen dem Nukleokapsid und den viralen Hüllproteinen kommt es zum Zusammenbau des viralen Partikels.

Jedoch liegen auch Berichte über Verpackungsmechanismen bei SFV-abgeleiteten Vektoren vor, die von diesem Prinzip abweichen. Es wurde beobachtet, dass Zellen nach Infektion mit einem eigentlich replikationsdefekten SFV-Vektor, der das Gen des Glykoproteins des Virus der vesikulären Stomatitis (VSV-G) überträgt, replizierende Virus-ähnliche Partikel abgeben, die das SFV-Replikon und eine Membranhülle mit VSV-G enthalten [20], die aber kleiner als SFV- oder VSV-Partikel sind. In diesem Bericht wird auch die Entstehung von solchen replizierenden Partikeln erwähnt, wenn mithilfe des SFV-Vektors das Glykoprotein des Rabies-Virus exprimiert wird, jedoch waren die von diesen Partikeln gebildeten Plaques in der Zellkultur kleiner als nach VSV-G-Expression, was bedeutet, dass die Vermehrungsfähigkeit in Abhängigkeit des exprimierten viralen Hüllproteins unterschiedlich ausfällt. In einem anderen Bericht wurde die Entstehung von replizierenden Virus-ähnlichen Partikeln beschrieben, wenn mithilfe des SFV-Vektors das Hüllprotein des murinen Leukämievirus exprimiert wird [21].

Somit kann bei eigentlich replikationsdefekten SIN- oder SFV-abgeleiteten Vektoren nicht ausgeschlossen werden, dass replizierende Virus-ähnliche Partikel ausgebildet werden, wenn als Transgen das Gen eines viralen Hüllproteins übertragen wird.

2 Zusammenfassung relevanter Kriterien für die Sicherheitseinstufung gentechnischer Arbeiten mit dem Sindbis Virus- und dem Semliki Forest Virus-Expressionssystem

Gefährdungspotenzial gentechnischer Arbeiten mit E. coli K12

Gentechnische Arbeiten mit E. coli K12-Derivaten, die Vektorplasmide einschließlich eines weiteren subgenomischen Nukleinsäureabschnitts oder die Helferplasmide enthalten, sind nach dem Stand von Wissenschaft und Technik ohne Risiko für die menschliche Gesundheit und die Umwelt.

Gefährdungspotenzial von Zellen mit viralem Replikon

Für die Sicherheitsbewertung von Zellen, auf welche Vektor-RNA übertragen wurde, ist die Möglichkeit der Entstehung viraler oder Virus-ähnlicher Partikel von Bedeutung. Hierbei ist unerheblich, ob die Vektor-RNA als in vitro transkribierte RNA übertragen wurde oder ob sie nach Übertragung von cDNA, die unter Kontrolle eines Polymerase II-Promotors steht, in der Zelle erst transkribiert wird. Wird in der Zelle kein virales Hüllprotein exprimiert, so können weder replikationskompetente noch replikationsdefekte Viruspartikel gebildet werden. Der Umgang mit solchen Zellen ist nach dem Stand von Wissenschaft und Technik ebenfalls ohne Risiko für die menschliche Gesundheit und die Umwelt, sofern das heterologe Protein kein Gefährdungspotenzial aufweist.

Bei den erwähnten Zellen wird davon ausgegangen, dass es sich um Zellen der Risikogruppe 1 handelt. Werden Zellen verwendet, die durch Infektion mit einem Mikroorganismus ein erhöhtes Gefährdungspotenzial aufweisen, ist dieses in die Risikobewertung einzubeziehen. Sind die Zellen mit Viren infiziert oder enthalten sie virale Hüllproteine, ist darüber hinaus eine Wechselwirkung mit diesen Viren bzw. Hüllproteinen zu berücksichtigen.

Gefährdungspotenzial der viralen Vektorpartikel

Bei Verwendung von Helfer-RNA mit vollständigem und unverändertem Leserahmen der Strukturproteine kann in den kotransfizierten Zellen die Entstehung replikationskompetenter, infektiöser Viren nicht ausgeschlossen werden. Die entsprechenden Arbeiten bergen daher ein geringes Risiko für den Menschen und die Umwelt.

Bei Verwendung von Helfer-RNA mit einer Dreifach-Mutation der proteolytischen Spaltstelle des E3/E2-Vorläuferproteins wird beim Umgang mit den viralen Vektorpartikeln vor ihrer Aktivierung nicht von einem Risiko für die menschliche Gesundheit und die Umwelt ausgegangen.

Ist die Helferfunktion auf zwei Helfer-RNAs verteilt, ist davon auszugehen, dass die viralen Vektorpartikel replikationsdefekt sind, sofern kein virales Hüllprotein exprimiert wird. Dennoch ist ein geringes Risiko für den Menschen vorhanden, da die replikationsdefekten viralen Vektorpartikel direkt infektiös sind.

Gefährdungspotenzial des Transgens

Werden virale Vektoren hergestellt oder verwendet, die als Transgen das Gen eines viralen Hüllproteins übertragen, kann nicht ausgeschlossen werden, dass diese viralen Hüllproteine auch in die Vektorhülle eingebaut werden oder selbst die Vektor-RNA verpacken, so dass nach Infektion weiterer Zellen Virus-ähnliche replizierende Partikel ausgebildet werden. Diese Partikel sowie die damit infizierten Zellen können ein geringes Gefährdungspotenzial aufweisen. Hiervon ausgenommen ist die Expression des Hüllproteins muriner ecotroper Retroviren (nicht Lake Casitas Virus) sowie die Expression des Hüllproteins der aviären Retroviren des Subtyps A und B, da diese Hüllproteine ohne Gefährdungspotenzial und sehr labil sind, und da sich ihr Wirtsbereich auf Mäuse und Ratten oder Vögel begrenzt.

3 Kriterien der Vergleichbarkeit gentechnischer Arbeiten mit dem Sindbis-Virus- und dem Semliki Forest-Virus-Expressionssystem

Im Folgenden werden allgemeine Kriterien der Vergleichbarkeit bei gentechnischen Arbeiten mit dem SIN- und SFV-Expressionssystem zusammengefasst. Die Kriterien gelten für gentechnische Arbeiten mit SIN- oder SFV-Vektoren, die ein Transgen ohne pathogenes Potenzial übertragen. Sollen Prion-Proteine oder Proteine mit transformierendem Potenzial exprimiert werden, ist eine Einzelfallbewertung erforderlich.

Hinweise

1. Bei den bewerteten Vektorplasmiden handelt es sich um pBRDerivate, die als cDNA von SIN oder SFV das Verpackungssignal ψ, das Replikon, welches sich aus cis-regulatorischen Sequenzen für Replikation und Translation der viralen RNA sowie dem Leserahmen der Nichtstrukturproteine zusammensetzt, und den subgenomischen Promotor enthalten. Sie verfügen darüber hinaus über eine Insertionsstelle für das heterologe Gen, Restriktionsschnittstellen zur Linearisierung des Plasmids, und zur Expression des viralen Replikons und des heterologen Gens entweder einen Promotor zur in vitro Transkription oder einen Polymerase II-Promotor.
2. Die bewerteten Helferplasmide sind pBR-Derivate, die als cDNA von SIN oder SFV cis-regulatorische Sequenzen für die Replikation und Translation der RNA, den Leserahmen eines oder mehrerer Strukturproteine enthalten, die aber kein Verpackungssignal ψ aufweisen und die zur Expression der Helfer-RNA entweder einen Promotor zur in vitro Transkription oder einen Polymerase II-Promotor enthalten.
3. Werden bei den Kriterien die Einführung von Vektor-RNA oder von Helfer-RNA in Zellen genannt, kann dies entweder durch Einführung in vitro transkribierter RNA oder durch Übertragung von Plasmiden mit den genannten Funktionen als cDNA unter Kontrolle eines Polymerase II-Promotors erfolgen.
4. Werden besondere Kriterien zur Expression viraler Hüllproteine aufgeführt, sind das Hüllprotein muriner ecotroper Retroviren (nicht Lake Casitas Virus) sowie das Hüllprotein der aviären Retroviren des Subtyps A und B ausgenommen.
5. Tiere, die mit solchen rekombinanten, replikationsdefekten SIN- bzw. SFV-Vektorpartikeln infiziert werden, bei denen von einer Kontamination mit replikationskompetenten, infektiösen Viren auszugehen ist, oder die mit solchen SIN- bzw. SFV-Vektorpartikeln infiziert werden, die ein virales Hüllprotein exprimieren und Virus-ähnliche Partikel ausbilden, sind in der Lage, GVO abzugeben. Die Sicherheitsmaßnahmen beim Umgang mit den infizierten Zellen bzw. für die Tierhaltungsräume richten sich daher nach der Risikogruppe des rekombinanten SIN- bzw. SFV-Vektorpartikels. Die infizierten Tiere werden selbst aber nicht zu GVO.

Tiere, die mit rekombinanten, replikationsdefekten SIN- bzw. SFV-Vektorpartikeln infiziert werden, bei denen nicht von einer Kontamination mit replikationskompetenten Viren auszugehen ist, sind keine GVO und auch nicht in der Lage, GVO abzugeben.

Übertragung von SIN- bzw. SFV-abgeleiteten Vektorplasmiden oder Helferplasmiden auf E. coli K12

3.1 Werden subgenomische virale oder zelluläre Nukleinsäureabschnitte mit Hilfe der o.g. Vektor-Plasmide in ein E. coli K12-Derivat eingeführt oder werden die o.g. Helferplasmide in ein E. coli K12-Derivat eingeführt, sind die gentechnisch veränderten Organismen der Risikogruppe 1 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 1 zuzuordnen.

Einführung der Vektor-RNA in eukaryote Zellen

3.2 Wird Vektor-RNA einschließlich eines subgenomischen viralen (Ausnahme: Hüllproteingen) oder zellulären Nukleinsäureabschnitts in eukaryote Zellen der Risikogruppe 1 eingeführt, sind die gentechnisch veränderten Organismen der Risikogruppe 1 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 1 zuzuordnen.

3.3 Wird Vektor-RNA einschließlich des Gens eines viralen Hüllproteins in eukaryote Zellen der Risikogruppe 1 eingeführt, sind die gentechnisch veränderten Organismen der Risikogruppe 2 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen.

Hinweis:

Wenn gezeigt wird, dass keine Virus-ähnlichen replizierenden Partikel gebildet werden, trifft das unter Nummer 3.2 genannte Kriterium zu.

3.4 Wird Vektor-RNA einschließlich eines subgenomischen viralen oder zellulären Nukleinsäureabschnitts in eukaryote Zellen der Risikogruppe 2 eingeführt, sind die gentechnisch veränderten Organismen der Risikogruppe 2 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen.

Erzeugung SIN- bzw. SFV-abgeleiteter Vektorpartikel

3.5 Wird Vektor-RNA einschließlich eines subgenomischen viralen oder zellulären Nukleinsäureabschnitts in eukaryote Zellen der Risikogruppe 1 eingeführt, und werden von diesen Zellen unveränderte SIN- bzw. SFV-Strukturproteine entweder durch konstitutive Expression oder durch transiente Expression nach Einführung von Helfer-RNA zur Verfügung gestellt, sind die gentechnisch veränderten Organismen der Risikogruppe 2 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen.

3.6 Wird Vektor-RNA einschließlich eines subgenomischen viralen (Ausnahme: Hüllproteingen) oder zellulären Nukleinsäureabschnitts in eukaryote Zellen der Risikogruppe 1 eingeführt, und werden von diesen Zellen SIN- bzw. SFV-Strukturproteine, die an der proteolytischen Spaltstelle des E3-E2-Vorläuferproteins dreifach mutiert sind, entweder durch konstitutive Expression oder durch transiente Expression nach Einführung von Helfer-RNA zur Verfügung gestellt, sind die gentechnisch veränderten Organismen der Risikogruppe 1 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 1 zuzuordnen.

3.7 Wird Vektor-RNA einschließlich des Gens eines viralen Hüllproteins in eukaryote Zellen der Risikogruppe 1 eingeführt, und werden von diesen Zellen SIN- bzw. SFV-Strukturproteine, die an der proteolytischen Spaltstelle des E3-E2-Vorläuferproteins dreifach mutiert sind, entweder durch konstitutive Expression oder durch transiente Expression nach Einführung von Helfer-RNA zur Verfügung gestellt, sind die gentechnisch veränderten Organismen der Risikogruppe 2 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen.

Hinweis:

Wenn gezeigt ist, dass das virale Hüllprotein nicht in der Vektorhülle vorliegt und die viralen Vektorpartikel nach Infektion weiterer Zellen keine Virus-ähnlichen replizierenden Partikel ausbilden, trifft das unter Nummer 3.6 beschriebene Kriterium zu.

Umgang mit SIN- bzw. SFV-Vektorpartikeln

3.8 Virale Vektorpartikel, die wie unter Nummer 3.5 beschrieben erzeugt wurden und zu deren Herstellung Helfer-RNA verwendet wurde, die einen vollständigen Leserahmen unveränderter viraler Strukturproteine enthält, sind infektiös und enthalten möglicherweise auch replikationskompetente Viren. Die so erzeugten gentechnisch veränderten Organismen sind der Risikogruppe 2 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen.

Hinweis:

Wenn gezeigt wird, dass keine replikationskompetenten viralen oder Virus-ähnlichen Partikel vorliegen, trifft das unter Nummer 3.9 genannte Kriterien zu.

3.9 Virale Vektorpartikel, die kein Hüllprotein exprimieren, die wie unter Nummer 3.5 beschrieben erzeugt wurden und zu deren Herstellung Helfer-RNA verwendet wurde, bei welcher der Leserahmen der unveränderten Strukturproteine in getrennte Helfergenome aufgeteilt ist, sind infektiös, aber replikationsdefekt. Die so erzeugten gentechnisch veränderten Organismen sind der Risikogruppe 2 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen.

3.10 Virale Vektorpartikel, die ein virales Hüllprotein exprimieren, und die wie unter Nummer 3.5 beschrieben erzeugt wurden und zu deren Herstellung Helfer-RNA verwendet wurde, bei welcher der Leserahmen der unveränderten Strukturproteine in getrennte Helfergenome aufgeteilt ist, sind infektiös und möglicherweise in der Lage, replizierende Virus-ähnliche Partikel auszubilden. Die so erzeugten gentechnisch veränderten Organismen sind der Risikogruppe 2 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen.

Hinweis:

Wenn gezeigt wird, dass keine Virus-ähnlichen replizierenden Partikel gebildet werden, trifft das unter Nummer 3.9 genannte Kriterium zu.

3.11 Virale Vektorpartikel, die wie unter Nummer 3.6 beschrieben erzeugt wurden, sind nicht infektiös. Die so erzeugten gentechnisch veränderten Organismen sind der Risikogruppe 1 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 1 zuzuordnen.

Hinweis:

Nach Aktivierung mit a-Chymotrypsin trifft das unter Nummer 3.9 beschriebene Kriterium zu.

3.12 Virale Vektorpartikel, die wie unter Nummer 3.7 beschrieben erzeugt wurden, sind möglicherweise schon vor ihrer Aktivierung infektiös und in der Lage, replizierende Virus-ähnliche Partikel auszubilden. Die so erzeugten gentechnisch veränderten Organismen sind der Risikogruppe 2 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen.

Hinweis:

Nach Aktivierung mit α-Chymotrypsin trifft das unter Nummer 3.10 beschriebene Kriterium zu.

Wenn gezeigt wird, dass keine Virus-ähnlichen replizierenden Partikel gebildet werden, trifft das unter Nummer 3.11 genannte Kriterium zu.

Infektion eukaryoter Zellen mit viralen Vektorpartikeln

3.13 Eukaryote Zellen der Risikogruppe 1, die mit den unter Nummer 3.8, 3.10 oder 3.12 beschrieben viralen Vektorpartikeln infiziert wurden, können replikationskompetente virale oder Virus-ähnliche Partikel der Risikogruppe 2 abgeben. Die so erzeugten gentechnisch veränderten Organismen sind der Risikogruppe 2 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen.

3.14 Eukaryote Zellen der Risikogruppe 1, die mit den unter Nummer 3.9 beschrieben viralen Vektorpartikeln infiziert wurden, geben keine replizierenden viralen Partikel ab. Die so erzeugten gentechnisch veränderten Organismen sind der Risikogruppe 1 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 1 zuzuordnen.

3.15 Eukaryote Zellen der Risikogruppe 1, die mit den unter Nummer 3.11 beschrieben aktivierten viralen Vektorpartikeln infiziert wurden, können virale Partikel der Risikogruppe 1 abgeben. Die so erzeugten gentechnisch veränderten Organismen sind der Risikogruppe 1 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 1 zuzuordnen.

3.16 Werden eukaryote Zellen der Risikogruppe 2 mit den unter Nummer 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 oder 3.12 beschrieben viralen Vektorpartikeln infiziert, sind die gentechnisch veränderten Organismen der Risikogruppe 2 zuzuordnen. Gentechnische Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, die die genannten Kriterien erfüllen, sind miteinander vergleichbar und der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen.

Literatur

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