1 Charakterisierung der Infektion

1.1 Erreger

Übertragbare spongiforme Enzephalopathien werden durch Infektionserreger verursacht, deren eigentliche Natur bisher noch nicht endgültig geklärt ist. Nach der Virus-Theorie besteht der Erreger aus einer Nukleinsäure und hierdurch kodierten Proteinen, nach der Virino-Theorie aus einer Nukleinsäure, die von zellulärem Protein eingehüllt ist. Weder für die Virus-Theorie noch für die "Virino-Theorie" gibt es wissenschaftlich fundierte Beweise. Allerdings entsprechen beide am ehesten dem uns geläufigen Bild eines Infektionserregers. Die Prion-Theorie unterscheidet sich davon grundlegend, weil hier von einem Protein als infektiösem Agens ausgegangen wird. Schon früh konnte gezeigt werden, daß sich bei der Aufreinigung des Erregers aus Gehirnmaterial eine Isoform eines zellulären Proteins zusammen mit der Infektiösität anreichert. Diese Isoform wird als sogenanntes Prion-Protein oder PrP^SC bezeichnet und soll das infektiöse Agens darstellen.

1.2 Klinische Symptomatik

Scrapie bei Schafen und Ziegen

Scrapie ist eine infektiöse neurologische Erkrankung des Schafes, die nun seit mehr als 200 Jahren bekannt ist. Klinische Symptome von Scrapie sind zu Beginn mentale Veränderungen (verändertes Verhalten in der Herde, Angsterscheinungen, Hypermotorik), die im späteren Krankheitsverlauf zu Bewegungskoordinationsstörungen (Ataxie) und Sensibilitätsstörungen (Pruritos) führen. Scheuern aufgrund von Pruritus (Juckreiz) führt zu einem Verlust der Wolle und kann Hautabschürfungen verursachen. Ein feinschlägiger Tremor, Krampfanfälle und Blindheit können auftreten. In späteren Krankheitsstadien kommt es häufig zu einem Konditionsverlust. Der Krankheitsverlauf von Scrapie kann eine Woche bis mehrere Monate dauern.

BSE

BSE ist eine infektiöse neurologische Erkrankung des Rindes. Die ersten Fälle dieser Erkrankung mit charakteristischen klinischen Symptomen traten im April 1965 in Großbritannien auf. Das klinische Bild der BSE ist sehr vielfältig. Erkrankte Tiere zeigen ein ungewöhnliches Verhalten und verändertes Temperament und können unter Nervosität, Tremor, Hyperästhesie und Juckreiz (verstärktes Kratzen und Belecken), Bewegungsstörungen (bis zum finalen Festliegen), Gewichts- und Konditionsverlust sowie Milchrückgang leiden. Häufig wird ein Treten der Tiere in die Einstreu oder nach Personen beobachtet. Fieber tritt in der Regel nicht auf. Die Krankheit verläuft protrahiert (3 Wochen bis 6 Monate Krankheitsdauer). Eine detaillierte und umfassende Beschreibung des klinischen Bildes von BSE findet sich in Braun et al., 1997: Deutsches Tierärzteblatt 45: 104-109.

Infolge der langen Inkubationszeit sind nur erwachsene Tiere klinisch betroffen. Das Alter erkrankter Tiere mit nachgewiesener BSE lag zwischen 22 Monaten und 15 Jahren, wobei 4 Jahre alte Tiere am häufigsten erkrankt waren. Der Ausbruch der Erkrankung ist unabhängig von Trächtigkeit, Laktationsperiode oder Jahreszeit, obwohl im Vereinigten Königreich mehr Fälle während der Kalbezeit gemeldet wurden.

1.3 Differentialdiagnosen

Als Differentialdiagnosen zu Scrapie könnten andere bakterielle oder virale Infektionen des zentralen Nervensystems erwogen werden (z.B. Bornasche Krankheit, Aujeszkysche Krankheit, Tollwut, Visna, Listeriose), raumfordernde Prozesse im Hirn (z.B. Tumore, Parasiten (Coenurus), Abszesse), Stoffwechselstörungen (z.B. CCN, Hypomagnesiämie, Hypokalziämie, Hepatoenzephalopathie) oder Hautkrankheiten (z.B. Räude).

Wichtige Differentialdiagnosen zur BSE sind Stoffwechselstörungen des Rindes (z.B. Hypomagnesiämle, nervöse Form der Ketose, Kupfermangel) sowie andere virale und bakterielle Infektionen des zentralen Nervensystems (z.B. Listeriose, Tollwut, Aujeszkysche Krankheit), Aggressionen psychogener Ursache.

1.4 Diagnostische Indikationen

Abklärung bei Tieren mit zentralnervösen Störungen bei klinisch oder epidemiologisch begründetem Verdacht.

1.5 Zuständige Untersuchungseinrichtungen -

• Staatliche Veterinäruntersuchungsämter für die Histologie
• Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere (nationales Referenzzentrum)

1.6 Verordnungen, Richtlinien

Entscheidung 98/272/EG der Kommission vom 23. April 1998 über die epidemiologische Überwachung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathie und zur Änderung der Entscheidung 94/474/EG (ABl. EG Nr. L 122 S. 59)

Verordnung zur Überwachung Transmissibler Spongiformer Enzephalopathien sowie zur Änderung der Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen vom 5. Mai 1999 (BGBl. I S. 844)

2 Untersuchungsmaterial

Folgende Maßnahmen sind durchzuführen, wenn bei Tieren aufgrund der klinischen Symptome BSE- oder Scrapie-Verdacht amtlich festgestellt wird.

2.1 Tötung von verdächtigen Tieren

Tiere mit hinreichender klinischer Symptomatik von BSE oder Scrapie sind vorzugsweise medikamentell schmerzlos zu töten oder durch elektrischen Strom, um weitere diagnostische Untersuchungen zu ermöglichen. Bolzenschußapparate sind nicht zur Tötung von verdächtigen Tieren einzusetzen. Außerdem sollte möglichst wenig Zeit (< 8 Stunden) vergehen, bis die benötigten Gewebeproben (siehe unten) entnommen werden.

Es ist anzunehmen, daß BSE nach Übertragung auf den Menschen der Erreger der neuen Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit ist. Natürliche Wirte des Scrapie-Erregers sind Schafe und Ziegen. Obwohl Scrapie experimentell (durch intrazerebrale Inokulation) auf Primaten übertragen werden konnte, gibt es momentan keine Hinweise auf eine natürliche Übertragbarkeit von Scrapie auf den Menschen. Unter Versuchsbedingungen gelang jedoch eine Übertragung von BSE auf Schafe. Da es Anhaltspunkte für eine Übertragbarkeit des BSE-Agens auf den Menschen gibt, ist die Einhaltung besonderer Vorsichtsmaßregeln beim Umgang mit potentiell infektiösem Material notwendig.

2.2 Allgemeine Regeln für Obduktionen

BSE- oder Scrapie-verdächtige Tierkörper sollen nur von eingewiesenen, in der Pathologie fachkundigen Tierärzten seziert werden. Die Zerlegung sollte nach Möglichkeit räumlich getrennt von anderen Sektionen durchgeführt werden; beim Vorliegen geeigneter Einrichtungen an den Tierkörperbeseitigungsanstalten sind diese hierfür zu empfehlen.

Während dieser Obduktion ist volle Schutzkleidung zu tragen (langer geschlossener Kittel, Gummischürze, Schutzbrille und wegwerfbare Mund-Nasen-Maske). Die Schutzkleidung sollte nur für diese Arbeiten verwendet und anschließend autoklaviert (134EC, mind. 20 min Eingangsdruck 3 bar) werden.

Ein gesondertes Sektionsbesteck sollte für die Arbeiten mit BSE- und Scrapiematerial zur Verfügung stehen. Eine Handsäge mit austauschbaren Klingen ist zu empfehlen.

Nach der Sektion sind die Räume (Oberflächen, Boden) und nichtautoklavierbaren Gegenstände mit einer Natriumhypochloritlösung (Achtung: korrosiv und toxisch) (Fa. Merck Best. Nr. 5614; 1:5 verdünnte Stammlösung entsprechend 2 % freiem Chlor in der Gebrauchslösung), 2N (8 %) Natronlauge (ätzend) oder unverdünnter Ameisensäure (95-100 %) zu desinfizieren. Die Einwirkungszeit der Desinfektionsmittel soll mindestens 60 min betragen, bevor mit Wasser nachgespült wird.

Hat sich der Untersucher während der Sektion verletzt, so ist die kontaminierte Wunde vor der eigentlichen Wundversorgung sorgfältig unter fließendem Wasser auszuspülen.

2.3 Probenentnahmen und Befunderhebung

Pathologische Befunde sind in ein Sektionsprotokoll aufzunehmen. Bei klinisch definierten Verdachtsfällen von BSE oder Scrapie sind notwendige histologische, bakteriologische und virologische Untersuchungen zur Abklärung differentialdiagnostisch wichtiger Erkrankungen (v.a. Tollwut) unter Anwendung entsprechender Schutz- und Desinfektionsmaßnahmen einzuleiten.

Untersuchungen an Gehirnmaterial sind nur unter Schonung der für die histopathologische und immunochemische BSE- und Scrapiediagnostik wichtigen Bereiche (s.u.) durchzuführen. Abklatschpräparate für den immuno-fluoreszenz-serologischen Nachweis von Tollwut können jeweils an den gegenüberliegenden Schnittflächen des rostral und caudal abgesetzten Hirnstammes sowie an einem wahlweise Schnitt durch das Kleinhirn erfolgen. Für den Tollwutvirusnachweis mittels Zellkultur kann eine 5 mm dicke Scheibe aus dem Hippocampus und von der Medulla oblongata caudal Schnittebene b (s. Proben für Histopathologie) entnommen werden. Zur Abklärung der Differentialdiagnose Aujeszkysche Krankheit ist die Erregerisolierung aus den Tonsillen und dem Bulbus olfactorius zu versuchen. Untersuchungen an anderem Gehirnmaterial auf Listerien und den Erreger der Aujeszkyschen Krankheit sind allerdings erst nach einem "negativen" Befund der histopathologischen Untersuchung einzuleiten (siehe Nr. 6). Hierzu können dann die ursprünglich für den Immunoblot reservierten Gehirnabschnitte Verwendung finden.

2.3.1 Probenentnahme und Aufteilung des Gehirns

Bei der histopathologischen Untersuchung werden degenerative Veränderungen im Stammhirnbereich beurteilt. Deshalb darf bei der Entnahme und Behandlung das Gehirn weder mechanisch beschädigt noch gequetscht werden. Das Messer für die Schnitte muß unbedingt scharf sein; ein Skalpell ist vorzuziehen. Um autolytische und bakterielle Zersetzungsvorgänge zu vermeiden, sollten die Proben so bald wie möglich entnommen und verarbeitet werden, d.h. Proben für die Histopathologie nur innerhalb von 8 Stunden nach dem Tode des Tieres.

Das Gehirn ist in toto zu entnehmen. Das Großhirn und das Kleinhirn sind dann mit Sorgfalt abzusetzen, so daß sich drei Teile ergeben: Großhirn, Kleinhirn und Hirnstamm.

2.3.1.1 Proben für die Histopathologie

1. Das Kleinhirn ist durch einen Medianschnitt in zwei Hälften zu teilen. Eine Hälfte sollte für weiterführende histologische Untersuchungen mit Formalin fixiert werden.
2. Ein rostraler (bulbus olfactorius+cortex frontalis) und ein caudaler (pars occipitalis) Teil des Großhirns sollte durch zwei Schnitte abgesetzt und die Proben mit Formalin fixiert werden.
3. Der Hirnstamm ist durch zwei transversale Schnitte abzusetzen:
   1. rostral eine Linie, definiert durch Epiphyse und Hypophyse. Ventral gesehen liegt die Schnittebene rostral vom Corpus mammilare und caudal vom Chiasma opticum.
   2. 1,5 cm caudal vom .Obex (caudales Ende der Rautengrube). Ursprung des N. hypoglossus (XII).

   Der mittlere Teil zwischen den transversalen Schnitten a) und b) muß für die Histopathologie entnommen und mit Formalin fixiert werden (siehe Abs. 4.2). Er besteht aus dem caudalen Abschnitt des Zwischenhirns, Mittelhirns und des Rhombenzephalons bis zum cranialen Teil der Medulla oblongata. Der Hirnstamm ist die wichtigste Untersuchungsprobe für die Histopathologie.
   Die empfohlenen Schnitte zur Aufteilung des Hirnstammes sind in Abbildung 1 dargestellt.

4. Bei kleinen Wiederkäuern: Eine Tonsilla palatina und ein Retropharyngeallymphknoten sollen für die immunhistologische Untersuchung formalinfixiert werden.

2.3.1.2 Proben für Immunoblot

Die folgenden Teile sollten in separaten Behältern aufbewahrt und bei -20 "C oder -70 °C (sofern vorhanden) eingefroren werden, um gegebenenfalls den immunochemischen Nachweis von pathologischem Prion-Protein zu ermöglichen:

1. Das halbe Kleinhirn
2. Das Großhirn (mit entfernter pars frontalis und pars occipitalis)
3. Zwei durch die transversalen Schnitte a) und b) vom Hirnstamm abzusetzende Untersuchungsproben (rostral vom Zwischenhirn und Medulla oblongata jeweils),
4. Das Rückenmark (C1 und C2) (sehr wichtige Probe). Die morphologische Erhaltung dieser Probe bei ihrer Entnahme ist nicht unbedingt erforderlich, jedoch anzustreben.
5. Bei kleinen Wiederkäuern: Eine Tonsilla palatina und ein Retropharyngeallymphknoten sollen eingefroren werden.

Das Rückenmark und die rostralen Zwischenhirnproben sind die geeignetesten Untersuchungsproben für den immunochemischen Nachweis des pathologischen Prionproteins bei BSE-kranken Tieren.

Bei Scrapie sind das Kleinhirn, das Zwischenhirn, die Medulla oblongata und die Rückenmarksproben in der Regel geeignete Proben für den Nachweis des pathologischen Prionproteins bei erkrankten Tieren. Da verschiedene Scrapiestämme jedoch unterschiedliche PrP^SC-Ansammlungsmuster ergeben können, sollten so viele verschiedene Hirnabschnitte wie möglich analysiert werden.

Alle entnommenen eingefrorenen oder in Fixierung befindlichen Teile bleiben im zuständigen Untersuchungsamt unter amtlicher Verwahrung.

2.3.1.3 Proben zum Identitätsnachweis

Zum Identitätsnachweis soll eine Ohrmuschel mit anheftender Ohrmarke und, sofern vorhanden, Blut asserviert werden.

2.3.2 Histopathologische Verarbeitung

Die für die Histopathologie gesammelten Proben (wie in 4.1.1 beschrieben) werden im zehnfachen Volumen (etwa 1-1,5 liter)

Formalinlösung fixiert. Diese Lösung wird wie folgt hergestellt:

Das Gewebe sollte in dieser Lösung 14 Tage lang bei Zimmertemperatur fixiert werden.

DA Formalin das Agens nicht inaktiviert, müssen alle Gewebeproben, einschließlich der Fixierungs-Lösung und der Behälter, als infektiös angesehen werden. Alle bei der Fixierung angefallenen Flüssigkeiten sind mit 2 N (8%) Natronlauge zu gleichen Teilen zu versetzen. Die Einwirkungszeit soll mindestens 24 h betragen. Behälter, in denen Formalin aufbewahrt wird, sollten nicht zusammen mit anderen Chemikalien gelagert werden, insbesondere nicht mit Hypochlorit-Lösungen (es kann die karzinogene Substanz Bis-Chlor-Methyl-Ether entstehen).

Zur Untersuchung werden am fixierten Hirngewebe Transversalschnitte in 3-5 mm Abständen vorgenommen. Erkennbare Läsionen werden protokolliert. Für die histologischen Untersuchungen auf BSE und Scrapie werden die folgenden Stellen zur Verarbeitung zu Paraffinblöcken empfohlen:

1. Medulla am Obex (caudales Ende der Rautengrube).
2. Medulla caudal am Kleinhirnstiel, Ursprung des N. intermediofacialis (VI) und des N. vestibulocochlearis (VIII)
3. Mittelhirn, auf Höhe der Colliculi rostrales, Ursprung des N. oculomotorius (III)

Vor der Verarbeitung zu Paraffinblöcken müssen die Gewebeproben (max. 5 mm Dicke) zur Erregerinaktivierung für 1 Stunde in 98-100% Ameisensäure eingelegt werden. So vorbehandelte Proben können routinemäßig weiterverarbeitet werden.

2.3.3 Histopathologische Befunderhebung

Am Veterinäruntersuchungsamt wird die histopathologische Untersuchung durchgeführt. Auch eine immunohistochemische Untersuchung kann zur weiteren Abklärung durchgeführt werden.

Histopathologisches Bild bei BSE

Histopathologisch sind bilateral-symmetrisch degenerative Veränderungen in bestimmten Lokalisationen der grauen Substanz des Stammhirns nachweisbar. Am stärksten betroffen sind der Nucleus tractus solitaril (Block A dorsomedial), der Nucleus tractus spinalis n. trigemini (Block A, B lateral) und das zentrale Höhlengrau des Mittelhirns (Block C) (Wells, 1993). Weiterhin sind in der Obexebene (Block A) die motorischen Kerne des N. vagus (X) und N. hypoglossus (XII) und in der Kleinhirnstielebene (Block B) die Vestibularkerne betroffen. Diese zeigen sich primär als Vakuolisierung des Neuroplis sowie durch Vakuolenbildung im Perikaryon von Neuronen. Das pathologische Prion-Protein kann immunohistochemisch nachgewiesen werden.

Histopathologisches Bild bei Scrapie

Das histopathologische Bild von Scrapie ist durch vakuoläre Veränderungen in der grauen Substanz, die bilateral und in der Regel symmetrisch verteilt sind, gekennzeichnet. Charakteristisch sind große Vakuolen im Perikaryon sowie Vakuolen im Neuropil (spongiforme Veränderungen). Die Vakuolenbildung im Perikaryon der Neuronen und im Neuropil sind im Stammhirn am ausgeprägtesten, inbesondere im Nucleus cuneatus (Block A dorsolateralis), Nucleus vestibularis med. (Block B nahe der Rautengrube) und Formatio reticularis (Block A, B zentral). Neuronale Degenerationen und Verluste, Gliosen und Amyloidose können auftreten. Das pathologische Prion-Protein kann immunohistochemisch nachgewiesen werden.

Beurteilung:

Typische Histopathologie bei BSE und Scrapie

Das Vorhandensein der charakteristischen Vakuolenbildung des Neuroplis der grauen Substanz (spongiforme Veränderungen) bzw. im Perikaryion von Neuronen, normalerweise bilateral-symmetrisch verteilt. Der Nachweis anderer Formen neuronaler Degeneration sowie eine astrozytäre Reaktion erhärten die Diagnose, soweit auch vakuoläre Veränderungen vorliegen. Eine spezifische Immunofärbung mittels Immunohistochemie deutet auch auf BSE und Scrapie hin.

Anmerkungen:

• bei BSE kommen spongiforme Veränderungen im Neuropil in der Regel häufiger vor als Vakuolenbildung des Perikaryons von Neuronen, bei Scrapie ist es umgekehrt.
• eine diffuse Vakuolenbildung der weißen Hirnsubstanz ist kein natürliches Merkmal von Scrapie oder BSE.
• es gilt zu unterscheiden zwischen spongiformen Veränderungen und Vakuolenbildung, die in Form oder Verteilung am wahrscheinlichsten ein Artefakt der Fixierung oder Verarbeitung ist (Wells und Wells, 1989)
• Die Vakuolenbildung des Perikaryons einzelner Neuronen im Nucleus ruber ist ein häufiger Nebenbefund bei Rinderhirnen (Wells et al., 1987)
• vereinzelte vakuolisierte Neuronen (1 oder 2 in einem Abschnitt der Medulla) bei fehlenden spongiformen Veränderungen im Neuropil der grauen Substanz können in Gehirnen scheinbar gesunder Schafe vorkommen (Zlotnik, 1958, Zlotnik und Rennie, 1958).

Nicht schlüssige histopathologische Ergebnisse

Eventuell muß eine unentschiedene Diagnose gestellt werden wegen:

1. dem Vorhandensein vakuolärer Veränderungen im Neuropil der grauen Substanz oder dem Perikaryon der Neuronen, die in der Schwere vom "Normalfall" nicht zu unterscheiden sind,
2. unsachgemäßer Aufbewahrung oder Darstellung der benötigten Gehirnabschnitte

Negative histopathologische Ergebnisse

Wenn bei der routinemäßigen histopathologischen Untersuchung keine Anzeichen beider Arten von Vakuolenbildung in einer Reihe von Abschnitten auftreten, die die wichtigen Hirnbereiche darstellen, bleibt die Scrapie- oder BSE-Diagnose unbestätigt und gilt aus praktischen Gründen als negativ.

Anmerkung: Zusätzliche Abschnitte, insbesondere vom Hirnstamm, sollten untersucht werden, wenn die klinischen Symptome sehr stark auf BSE oder Scrapie hindeuten oder eine vorklinische Krankheit vermutet wurde.

2.4 Weiterführende Untersuchungen

Bestätigt sich der BSE- oder Scrapieverdacht bei der histopathologischen Untersuchung oder verläuft die Untersuchung unentschieden, werden alle Gehirnproben (fixiertes Material, Paraffinblöcke und eingefrorenes Material) umgehend an die Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere, Paul-Ehrlich-Straße 28, 72076 Tübingen (Tel.: 07071/967-0, Fax.: 07071/967-105,-303,-305) zur Enddiagnose versandt. Das Material soll in separaten, geschlossenen Gefäßen in einem dichten und bruchsicheren Transportbehältnis versandt werden. Fixiertes Gewebe für die histopathologische Untersuchung darf nicht gefrieren. Dem Material ist ein Schreiben beizufügen, in dem alle sachdienlichen Angaben über den Verdachtsfall enthalten sind.

Abbildung 1: Hirnstamm nach Entfernung des Kleinhirns a) Ansicht von dorsal b Ansicht von lateral. Zur Verarbeitung zu Paraffinblöcken empfohlene Schnittebenen:

A-A: Medulla am Obex, B-B: Medulla caudal am Kleinhirnstiel, CC: Mittelhirn durch Colliculi rostrales

3 Differentialdiagnosen

Ergibt sich bei der histopathologischen Untersuchung oder anderweitig kein Hinweis auf das Vorliegen von BSE oder Scrapie, so können differentialdiagnostische Untersuchungen auf Listeriose und Aujeszkysche Krankheit mit den ursprünglich für den Immunoblot vorgesehenen Gehirnabschnitten durchgeführt werden. Die Untersuchungen können dann abgeschlossen werden, und die restlichen Gehirnproben gemäß den Routineprotokollen verarbeitet werden.

ENDE