TRGS 910-79: Hydrophile und lipophile Azofarbstoffe

(BArbBl. 4/91 S. 47)

Die Einstufung von hydrophilen und lipophilen Azofarbstoffen und ihren Zubereitungen (Einstellungen) in die Gruppen I, II bzw. III des Anhangs II GefStoffV richtet sich nach der Einstufung des potentiell freisetzbaren krebserzeugenden Amins, dessen Gehalt im Azofarbstoff und dem Gehalt des Azofarbstoffes in der Zubereitung (Einstellung).

Definition

Azoverbindungen sind charakterisiert durch das Strukturelement der chromophoren Azogruppe -N=N-, deren Stickstoffatome jeweils mit Kohlenstoffatomen verbunden sind. Ein technisch wichtiges Herstellungsverfahren besteht in der Reaktion von primären Aminen mit Nitrosylgruppen abspaltenden Verbindungen (z.B. Natriumnitrit) unter Bildung des Diazoniumsalzes (Diazotierung), welches nachfolgend mit einem nukleophilen Partner elektrophil substituiert wird (Kupplung).

Entsprechend der DIN 55943 wird der Begriff Farbmittel als Oberbegriff für alle farbgebenden Stoffe verwendet. In der weiteren Unterteilung wird unterschieden zwischen im Anwendungsmedium löslichen Farbstoffen und aus Teilchen bestehenden, im Anwendungsmedium praktisch unlöslichen Pigmenten (1). Unter den synthetischen Farbmitteln stellen die Azofarbmittel nach Zahl und Produktion die größte Gruppe dar, da für Diazotierung und Kupplung eine große Anzahl von Ausgangsprodukten zur Verfügung steht, deren Kombinationsmöglichkeit zu vielen unterschiedlichen Azofarbmitteln führt (2). Hydrophile (wasserlösliche) Arofarbstoffe enthalten meist ein oder mehrere Sulfonsäure-, Carbonsäure- und/oder Sulfonamidgruppen, lipophile (fettlösliche) häufig Hydroxyl-, Methyl-, Methoxy- und Aminogruppen (3).

Epidemiologische Befunde

In mehreren Industriezweigen und Berufen konnte ein erhöhtes Blasenkrebsrisiko der Beschäftigten nachgewiesen werden. In einigen findet regelmäßig ein Umgang mit kanzerogenen Aminen statt, die Ursache für das erhöhte Blasenkrebsrisiko sind. In anderen Berufsgruppen mit erhöhtem Blasenkrebsrisiko besteht eine Belastung durch Azofarbstoffe. Insbesondere für den Umgang mit Azofarbstoffen auf der Basis von Benzidin liegen Hinweise auf eine Blasenkrebs induzierende Wirkung beim Menschen vor (4, 5).

Kanzerogenität im Tierversuch

Mehrere Azofarbstoffe sind tierexperimentell auf kanzerogene Wirksamkeit untersucht worden. Verfütterung von 3 hydrophilen Azofarbstoffen auf Benzidin-Basis (Direct Blue 6, Direct Black 38, Direct Brown 95) führte bei F344-Ratten zu einer starken kanzerogenen Wirkung. Nach der kurzen Versuchszeit von nur 13 Wochen wurde eine signifikante Erhöhung von neoplastischen und präneoplastischen Leberveränderungen beobachtet. Bei B6C3F₁-Mäusen traten keine neoplastischen Veränderungen auf (22). Der lipophile Azofarbstoff o-Aminoazotoluol ist in der Liste der krebserzeugenden Gefahrstoffe des Anhangs II GefStoffV enthalten. Bei anderen Azofarbstoffen ist jedoch oft wegen verschiedener Mängel der Studien eine Bewertung der krebserzeugenden Wirkung nicht möglich (z.B. zu kleine Tierzahlen, unzureichende Versuchsbeschreibung und Versuchsdauer, fehlende Kontrollgruppe) (6, 7, 8.9).

Reduktive Azospaltung

Schon länger ist bekannt, daß die Azogruppe in vitro und in vivo reduktiv unter Bildung der entsprechenden Amine gespalten werden kann. Die natürlicherweise im Magen-Darm-Trakt vorhandenen Bakterien, wie auch Enzymsysteme in verschiedenen Geweben von Säugern, sind zur reduktiven Azospaltung fähig. Sie konnte für mehrere Versuchstierspezies und für den Menschen nachgewiesen werden (4).

Vor allem mit hydrophilen, aber auch mit einigen wenigen lipophilen Azofarbstoffen sind nach oraler Applikation quantitative Untersuchungen zum Ausmaß der Azospaltung durchgeführt worden. Insgesamt ist eine große Bandbreite in den Spaltungsraten in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren festzustellen:

• Je nach untersuchtem Azofarbstoff findet bei vergleichbarer Methodik eine relativ geringe bis vollständige Spaltung statt. Direct Blue 15(hydrophiler Azofarbstoff auf der Basis von Dimethoxybenzidin) wird zu ungefähr 6% (10), Carmoisin (hydrophiler Azofarbstoff aus substituiertem alpha- und ß-Naphthylamin) vollständig (11) und 3'Methyl-4-(dimethylamino)azobenzol (lipophil) zu ungefähr 60% (24) gespalten.
• Verschiedene Arbeitsgruppen ermittelten für den gleichen Azofarbstoff in der gleichen Versuchstierspezies nach oraler Verabreichung unterschiedliche Spaltungsraten. Für Direct 39 (hydrophiler Azofarbstoff auf der Basis von Dimethylbenzidin) wird sowohl eine 15 %ige (12) als auch eine nur qualitativ nachweisbare Spaltung beschrieben (13). Ob dieser Unterschied auf die Verabreichung verschiedener Dosen (10 bzw. 100 mg/kg Körpergewicht), der Verwendung verschiedener Rattenstämme (Fischer 344 bzw. Sprague-Dawley) oder auf den Einsatz unterschiedlich empfindlicher Analysenmethoden (EC- bzw. N/P-Detektor) zurückzuführen ist, kann nicht entschieden werden, da entsprechende Vergleichsdaten fehlen.
• In vergleichenden Untersuchungen waren teilweise deutliche Speziesunterschiede in den Spaltungsraten für denselben Azofarbstoff festzustellen. Nach Verabreichung von hydrophilen Azofarbstoffen auf Benzidin-Basis zeigten Hunde eine deutlich stärkere Spaltung als Ratten (13). Dieser Befund ist insofern von Bedeutung, da der Hund wie der Mensch nach Belastung mit Benzidin Blasentumoren entwickelt (23). Nach oraler Verabreichung von Phenazopyridin (lipophil) wird beim Menschen ungefähr 50% der verabreichten Dosis als Spaltprodukte mit dem Urin ausgeschieden, beim Kaninchen ca. 65 % der verabreichten Dosis (25).
• Bei Affen. die dem Menschen phylogenetisch näher stehen als der Hund. wurde nach oraler Verabreichung von vier hydrophilen Azofarbstoffen auf Benzidin-Basis eine vollständige Spaltung ermittelt (14) Bei einem dieser Farbstoffe (Direct Red 28) war dagegen beim Hund nur eine Spaltung von ca. 40% festzustellen (13).

Die kanzerogene Wirkung von Azofarbstoffen muß aber nicht ausschließlich auf der Freisetzung eines kanzerogenen Amins beruhen, da Anhaltspunkte dafür vorliegen, daß auch das intakte Farbstoffmolekül oder das durch partielle Reduktion entstehende Produkt kanzerogen wirksam sein können. Für die hydrophilen Azofarbstoffe auf Benzidin-Basis Direct Blue 6, Direct Black 38 und Direct Brown 95 muß diese Frage offen bleiben. Zwar wurde im Urin der Ratten und Mäuse Benzidin und Monoacetylbenzidin nachgewiesen (22). Zum Vergleich geeignete Experimente mit Benzidin fehlen aber, da andere Rattenstämme untersucht und andere Applikationsformen angewendet wurden. Für Dimethylaminoazobenzol (lipophil) konnte jedoch gezeigt werden, daß die Azogruppe wesentlich für die Kanzerogenität ist, da bei Verfütterung der reduktiven Spaltprodukte Anilin und N,N-Dimethyl-4~phenylendiamin keine Tumorigenität beobachtet werden konnte (15).

Dieser Befund wird gestützt durch in vitro-Untersuchungen zur reduktiven Spaltung von Dimethylaminoazobenzol und vier seiner Strukturanaloga: weder die Azospaltung durch die intestinale bakterielle Flora, noch durch die hepatische Azoreduktase korrelierten mit der Kanzerogenität dieser Verbindungen (16).

Eine Bestätigung findet dieses Ergebnis an der Analyse der DNA-Addukte nach der oralen Verabreichung von N-Methyl-4-amino-benzol, einer weiteren strukturell ähnlichen Azoverbindung, an Ratten: nur DNA-Addukte mit intakter Azogruppe konnten identifiziert werden (26, 27).

Nach intraperitonealer Injektion von radioaktiv markiertem Direct Blue 6, einem hydrophilen Azofarbstoff mit zwei Azogruppen auf Benzidin-Basis, konnte neben dem DNA-Addukt von N-Acetylenbenzidin auch ein DNA-Addukt wahrscheinlich gemacht werden, das die reduktive Spaltung nur einer Azogruppe voraussetzt (20).

In Ames-Test-Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß einige Azofarbstoffe eine höhere mutagene Aktivität besitzen als ihrem Gehalt an freisetzbarem Amin entspricht (17, 18, 19).

Einstufung von hydrophilen und lipophilen Azofarbstoffen

Wegen der insgesamt unzureichenden Datenlage, der bestehenden Unsicherheiten bezüglich des Ausmaßes der reduktiven Azospaltung bei einem bestimmten Azofarbstoff, des Hinweises, daß die für den Menschen relevanteren Versuchstierspezies eine höhere Spaltungsrate zeigen als die üblicherweise untersuchte Ratte und der Möglichkeit, daß auch das intakte oder nur teilweise reduktiv gespaltene Molekül eine kanzerogene Wirksamkeit besitzen kann, wird aus Präventionsgründen jeweils eine vollständige Freisetzung des krebserzeugenden Amins aus dem hydrophilen oder lipophilen Azofarbstoff nach Aufnahme in den Organismus angenommen. Im Vergleich zu hydrophilen sind mit lipophilen Azofarbstoffen noch weniger Untersuchungen zur reduktiven Azospaltung durchgeführt worden. Die vorliegenden Daten entsprechen jedoch denjenigen der hydrophilen Azofarbstoffe.

Die Einstufung von hydrophilen und lipophilen Azofarbstoffen und ihrer Zubereitungen (Einstellungen) in die Gruppen I. II bzw. III des Anhangs II GefStoffV richtet sich demzufolge nach der Einstufung des potentiell freisetzbaren krebserzeugenden Amins, dessen Gehalt im Azofarbstoff und dem Gehalt des Azofarbstoffes in der Zubereitung (Einstellung).

Wird für einen hydrophilen oder lipophilen Azofarbstoff und dessen Zubereitungen (Einstellungen) eine deutlich geringere Freisetzung des krebserzeugenden Amins zweifelsfrei nachgewiesen, so kann dies berücksichtigt werden und gegebenenfalls zu einer Entlastung des betreffenden Farbstoffes und seiner Zubereitungen (Einstellungen) führen. Eine Bewertung diesbezüglicher Untersuchungsergebnisse und eventuelle Entlastung des Azofarbstoffes erfolgen durch die zuständigen Institutionen.

Beispiel:

• hydrophiler Azofarbstoff: Evans Blue (Direct Blue 53, C.I..23860; enthält 3.3'-Dimethylbenzidin)
  • Summenformel: C₃₄H₂₄O₁₄N₆Na₄S₄
  • Molekulargewicht.. 960.82
• Molekulargewicht des 3,3'-Dimethylbenzidins 212
• Anteil des 3,3'-Dimethylbenzidins an einer Gewichtseinheit Evans Blue: 22,1 %
• Einstufung von 3,3'-Dimethylbenzidin im Anhang II GefStoffV: Gruppe II: >0,5%, Gruppe III: < 0.5-0,05%
• Ein Gefahrstoff, der Evans Blue enthält, ist in die Gruppe II einzustufen bei einem Gehalt an Evans Blue > 2,26 % und in Gruppe III bei einem Gehalt von < 2,26-0,226 %

(1) DIN 55943. Ausgabe September 1984.

(2) Ullmanns Encyclopädie der Technischen Chemie; Bd. 8. 4. Auflage 1974, Verlag Chemie, Weinheim.

(3) Colour Index, Third Edition. The Society of Dyers and Colourists and the American Association of Textile Chemists and Colorists. Lund Humphries, Bradford and London. S. 4013.1971.

(4) Z. W. Myslak; H. M. Bolt: Berufliche Exposition gegenüber Azofarbstoffen und Harnblasenkarzinom-Risiko. Zbl. Arbeitsmed. 38, 310-321 (1988).

(5) C. A. Gonzales et al.: Bladder cancer among workers in the textile industry: Results of a Spanish case-control study. Am. J. Ind. Med. 14, 673-680 (1988).

(6) IARC Monographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Man; Vol. 8: Some aromatic azo compounds, Lyon, 1975.

(7) NIOSH. Technical Report: The Carcinogenicity and metabolism of azo dyes, especially those derived from benzidine. DHHS (NIOSH) Publication 80 119, July 1980.

(8) IARC Monographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans; Vol. 29: Some Industrial chemicals and Dyestuffs, Lyon 1982.

(9) E. Longstaff: An assesament and categorisation of the animal carcinogenidty data on selected dyestuffs and an extrapolation of those data to an evaluation of the relative carcinogenic risk to man. Dyes and Pigments 4, 243-304 (1983).

(10) M. C. Bowinan et al.: Metabolism and distribution of two 14C-benzidinecongener-based dyes in rats as determined by GC. HPLC and radioassays. J. Anal. Toxicol. 6, 164-174 (1982).

(11) E. Tragni et al.: Similar profile of urinary and faecal metabolites of , 14C-Carmoisine in male and pregnant female rats after oral administration. J. Appl. Toxicol. 5, 273-276 (1985).

(12) M. C. Bowinan et al.: Metabolism of nine benzidine-congener-based azo dyes in rats based on gas chromatographic assays on the urine for potentially carcinogenic metabolites. J. Anal. Toxicol. 7, 55-60 (1983).

(13) R. K. Lynn et al.: Metabolism of bisazophenyl dyes derived from benzidine, 3,3'-dimethylbenzidine or 3,3'-dimethoxybenzidine to carcinogenic aromatic amines in the dog and rat. Toxicol. Appl. Pharmacol. 56, 248-258 (1980).

(14) E. Rinde et al.: Metabolic reduction of benzidine azo dyes to benzidine in the rhesus monkey. J. Natl. Cancer Inst. 55(1). 181-182 (1975).

(15) R. C. Garner, C. N. Martin, D. B. Clayson: Carcinogenic aromatic amines and related compounds in: Charles E. Searle (ed.): Chemical caircinogens, S.175-276. ACS Monograph 182, Washington D. C., 1984.

(16) B. M. Elliot: Azoreductase activity of Sprague-Dawley and Wistar-derived rats towards both carcinogenic and noncarcinogenic analogues of 4-dimethylaminoazobenzene (DAB). Carcinogenesis 5(8). 1051-1055. 1984.

(17) A. R. Gregory et al.: Ames testing of Direct Black 38 parallels cardnogenicity testing. J. Appl.. Toxicol. 1(6), 308-313 (1981).

(18) T. M. Reid et al.: Mutagenicity of azo dyes following metabolism by different reductive/oxidative systems. Environ. Mutagen. 6, 705-717 (1984).

(19) G. Krishna et al.: Comparative mutagenicity studies of azo dyes and their reduction products in Samonella thyphimurium. J. Toxicol. Environ. Health 18, 111-119 (1986).

(20) J. C. Kennelly et al.: Reduction to benzidine is not necessary for the covalent binding of a benzidine azodye to rat liver DNA. Toxicology 32, 315-324 (1984).

(21) Griswald D. P. jr. et al.: The carcinogenicity of multiple intragastric doses of aromatic and heterocyclic nitro or amino derivates in young female Sprague-Dawley rats. Cancer Res. 28, 924-933 (1968).

(22) Robens J. F. et al.: Thirteen-week subchronic toxicity Studies of Direct Blue 6. Direct Black 38 and Direct Brown 95 dyes, Toxicol. Appl. Pharmacol. 54, 431-442 (1980).

(23) Spitz S. et al.: The carcinogenic action of benzidine. Cancer 3, 789-804 (1950).

(24) Mori Y. et al.: Analysis of biliary and urinary metabolites of 3'-Methyl-4-(dimethylamino)azobenzene in rats. Gann 69, 757-762 (1978).

(25) Johnson W J. et al.: The metaholism and excretion of phenazopyridine hydrochloride in animals and man. Toxicol. Appl. Pharmacol. 37 371-376 (1976).

(26) Tillis D. L. et al.: A comparison of the carcinogen-DNA adducts formed in rat liver in vivo after administration of single or multiple doses of N-methyl-4-aminoazobenzene. Chem. Biol. Interactions 38,15-27 (1981).

(27) Tullis D. J. et al.: Characterization and properties of the DNA adducts formed from N-methyl-4-aminoazobenzene in rats during carcinogenic treatment regimen. Carcinogenesis 8(4), 577-583 (1987).

Fußnoten

1) hydrophile Azofarbstoffe 5. Anhang II Nr.1.1 Abs. 4 GefStoffV

2) Cadmiumchlorid s. Anhang II, Nr.1.1 Abs. 1 GefStoffV

3) Cobaltmetall, Cobattoxid und Cobaltsulfid s. Anhang II. Nr.1.1 Abs. 1 GefStoffV