mit 50 Quadraten markierte tabletts zur Aufbewahrung von Proben von je ca. 2 g Fleisch oder andere Instrumente, welche die Rückverfolgbarkeit der Proben auf gleichwertige Weise sicherstellen;
Fleischwolf oder elektrischer Mixer;
Stomacher Labblender 3 500 Thermo-Modell;
Plastiktüten für Stomacher Labblender;
2 Liter fassende Scheidetrichter, möglichst mit Teflonstopfen (Sicherheitsverschluss);
Stative, Ringe und Klammern;
Siebe, Maschenweite 180 Mikron, Außendurchmesser 11 cm mit Maschen aus rostfreiem Stahl oder Messing;
Plastiktrichter mit mindestens 12 cm Innendurchmesser zum Einhängen der Siebe;
100-ml-Glasmessbecher;
ein Thermometer, das im Bereich 1 bis 100 °C auf ± 0,5 °C genau ist;
ein Vibrator, z.B. ein Elektrorasierer ohne Kopf;
ein Elektrorelais, das jede Minute an- bzw. ausschaltet;
Trichinoskop mit Horizontaltisch oder Stereomikroskop mit einstellbarem Durchlicht;
ein Larvenzählbecken und eine Reihe von Petrischalen mit 9 cm Durchmesser wie in Kapitel I Absatz 1 Buchstaben l und m;
17,5 %ige Salzsäure;
Pepsin, Stärke 1: 10.000 NF (US National Formulary) entsprechend 1: 12.500 BP (British Pharmacopoea) und entsprechend 2000 FIP (Federation Internationale de Pharmacie) oder stabilisiertes flüssiges Pepsin mit mindestens 660 Einheiten/ml (Europäisches Arzneibuch);
eine Reihe von 10-Liter-Gefäßen zur Dekontamination der Geräte, beispielsweise mit Formol, und für die Verdauungsflüssigkeit, wenn ein positiver Befund festgestellt wird;
Durch vorheriges Mahlen der Fleischproben in einem Fleischwolf wird der Verdauungsprozess verbessert. Wird ein elektrischer Mixer verwendet, muss dieser drei- bis viermal für jeweils etwa eine Sekunde betätigt werden.
Bei diesem Verfahren können vollständige Ansätze (gleichzeitige Untersuchung von 100 g Proben) oder Ansätze von weniger als 100 g untersucht werden.
Vollständige Ansätze (gleichzeitige Untersuchung von 100 Proben)
In den Stomacher Labblender 3 500 werden zwei ineinander gesteckte Plastiktüten eingesetzt und der Temperaturregler auf 40 bis 41 °C eingestellt.
1,5 Liter Wasser, auf 40 bis 41 °C vorgewärmt, werden in die innere Plastiktüte gefüllt.
25 ml einer 17,5 %igen Salzsäurelösung werden dem Wasser im Stomacher zugesetzt.
Von jeder Einzelprobe gemäß 2 werden 100 Proben von ca. 1 g (bei 25 bis 30 °C) hinzugefügt.
Schließlich werden 6 g Pepsin oder 18 ml flüssiges Pepsin hinzugefügt. Diese Reihenfolge ist streng einzuhalten, um die Zersetzung des Pepsins zu vermeiden
Der Stomacher bearbeitet dann 25 Minuten lang den Inhalt des Beutels.
Dann wird der Plastikbeutel dem Stomacher entnommen und die Verdauungsflüssigkeit durch das Sieb in einen 3-Liter-Kolben abgefiltert.
Der Plastikbeutel wird mit rund 100 ml Wasser ausgewaschen, mit denen anschließend das Sieb gespült wird und die dabei dem Filtrat im Kolben hinzugefügt werden.
Bis zu 15 Einzelproben können einer Sammelprobe von 100 Proben hinzugefügt und zusammen mit diesen untersucht werden.
Kleinere Ansätze (weniger als 100 Proben)
In den Stomacher Labblender 3 500 werden zwei ineinander gesteckte Plastiktüten eingesetzt und der Temperaturregler auf 40 bis 41 °C eingestellt.
Die Verdauungsflüssigkeit wird durch Mischen von 1,5 Liter Wasser und 25 ml 17,5 % iger Salzsäure hergestellt. 6 g Pepsin werden hinzugefügt; das Ganze wird bei 40 bis 41 °C gemischt. Diese Reihenfolge ist streng einzuhalten, um die Zersetzung des Pepsins zu vermeiden.
Von der Verdauungsflüssigkeit wird eine Menge, die jeweils 15 ml pro Gramm Probenmaterial entspricht (z.B. werden für 30 Proben 30 × 15 ml oder 450 ml benötigt) abgemessen und in den inneren der beiden Plastikbeutel gegeben, zusammen mit den Fleischproben von je ca. 1 g (bei 25 bis 30 °C), die jeder der einzelnen Proben gemäß Absatz 2 entnommen wurden.
Wasser von ca. 41 °C wird in den äußeren Beutel gegossen, bis in den beiden Beuteln ein Volumen von zusammen 1,5 Litern erreicht ist. Der Stomacher bearbeitet dann 25 Minuten lang den Inhalt des Beutels.
Dann wird der Plastikbeutel dem Stomacher entnommen und die Verdauungsflüssigkeit durch das Sieb in einen 3-Liter-Kolben abgefiltert.
Der Plastikbeutel wird mit rund 100 ml Wasser (bei 25 bis 30 °C ) ausgewaschen, mit denen anschließend das Sieb gespült wird und die dann dem Filtrat im Kolben hinzugefügt werden.
Eis (300 bis 400 g Eisflocken, Eispulver oder gemahlenes Eis) wird der Verdauungsflüssigkeit zugesetzt, bis ein Volumen von rund 2 Liter erreicht ist. Die Verdauungsflüssigkeit wird so lange gerührt, bis das Eis geschmolzen ist. Bei kleineren Ansätzen (vgl. II b) ist die Eismenge entsprechend herabzusetzen.
Die gekühlte Verdauungsflüssigkeit wird in einen 2-Liter-Scheidetrichter, der mit einem an separater Klemme befestigten Vibrator versehen ist, abgefüllt.
Der Scheidetrichter wird 30 Minuten lang zur Sedimentation stehen gelassen, wobei 1 Minute Vibration und 1 Minute Pause abwechseln.
Nach 30 Minuten wird eine Probe von 60 ml des Sediments schnell in einen 100-ml-Messzylinder auslaufen gelassen. (Der Trichter wird nach Verwendung mit Seifenlösung gespült.)
Die 60-ml-Probe wird mindestens 10 Minuten lang stehen gelassen, danach wird der Überstand durch Absaugen entfernt, bis ein Volumen von 15 ml verbleibt, das auf Vorhandensein von Larven untersucht wird.
Für das Absaugen wird eine Plastikspritze, die mit einem Plastikröhrchen versehen ist, verwendet. Das Röhrchen muss so lang sein, dass 15 ml im Messzylinder verbleiben, wenn beim Absaugen die Flanke der Spritze auf den Zylinderrand gesetzt wird.
Die verbleibenden 15 ml werden in ein Larvenzählbecken oder zwei Petrischalen gegossen und mit dem Trichinoskop bzw. dem Stereomikroskop untersucht.
Der Messzylinder wird mit 5 bis 10 ml Leitungswasser ausgespült, und dieses Spülwasser der Probe hinzugefügt.
Die Sedimente müssen untersucht werden, sobald sie vorbereitet sind. Die Untersuchung darf unter keinen Umständen auf den nächsten Tag verschoben werden.
Sind die Sedimente nicht klar oder werden sie nicht innerhalb von 30 Minuten nach Vorbereitung untersucht, so sind sie wie folgt zu klären:
Die endgültige Probe von 60 ml wird in einen Messzylinder gegossen und 10 Minuten stehen gelassen. 45 ml des Überstands werden durch Absaugen entfernt, das verbleibende Volumen von 15 ml wird mit Leitungswasser auf 45 ml aufgefüllt.
Nach einer weiteren Absetzzeit von 10 Minuten werden 30 ml des Überstands abgesaugt und die restlichen 15 ml zur Untersuchung in eine Petrischale oder ein Larvenzählbecken gegossen.
Der Messzylinder wird mit 10 ml Leitungswasser gespült; dieses Spülwasser wird ebenfalls der in der Petrischale bzw. im Larvenzählbecken befindlichen Probe hinzugefügt und untersucht.
1-Liter-Gelman-Trichter mit Filterhalter (Durchmesser 45 mm);
Filterscheiben, bestehend aus: rundem Sieb aus rostfreiem Stahl mit Maschengröße von 35 Mikron (Scheibendurchmesser: 45 mm), zwei Gummiringen aus 1 mm dickem Gummi (Außendurchmesser: 45 mm, Innendurchmesser: 38 mm); das runde Sieb wird zwischen den beiden Gummiringen angebracht und mit einem für beide Materialien geeigneten Zweikomponentenkleber angeklebt;
3-Liter-Erlenmeyerkolben mit seitlichem Rohr zum Absaugen;
Durch vorheriges Mahlen der Fleischproben in einem Fleischwolf wird der Verdauungsprozess verbessert. Wird ein elektrischer Mixer verwendet, muss dieser drei- bis viermal für jeweils etwa eine Sekunde betätigt werden.
Eis (300 bis 400 g Eisflocken, Eispulver oder gemahlenes Eis) wird der Verdauungsflüssigkeit zugesetzt, bis ein Volumen von rund 2 Liter erreicht ist. Bei kleineren Sammelproben ist die Eismenge entsprechend herabzusetzen.
Die Verdauungsflüssigkeit wird so lange gerührt, bis das Eis geschmolzen ist. Die gekühlte Verdauungsflüssigkeit wird mindestens 3 Minuten stehen gelassen, damit die Larven sich einrollen können.
Der Gelman-Trichter mit Filterhalter wird mit einer Filterscheibe auf einen Erlenmeyerkolben montiert, der an eine Filterpumpe angeschlossen ist.
Die Verdauungsflüssigkeit wird in den Gelman-Trichter gegossen und gefiltert. Gegen Ende des Filterungsvorgangs kann der Durchgang der Verdauungslösung durch den Filter mit Hilfe der Filterpumpe unterstützt werden. Das Absaugen muss unmittelbar bevor der Filter trocken wird, d. h. wenn noch 2 bis 5 ml im Trichter verbleiben, eingestellt werden.
Sobald die gesamte Verdauungsflüssigkeit gefiltert ist, wird die Filterscheibe entfernt, in einen 80 ml Plastikbeutel gegeben, in den 15 bis 20 ml Rennilase-Lösung gegossen werden. Die Rennilase-Lösung besteht aus 2 g Rennilase in 100 ml Leitungswasser.
Der Plastikbeutel wird zweifach verschweißt und in einen Stomacher zwischen den inneren und den äußeren Beutel gegeben.
Der Stomacher bearbeitet dann 3 Minuten lang den Inhalt des Beutels, z.B. eine vollständige oder unvollständige Sammelprobe.
Nach 3 Minuten wird der Plastikbeutel zusammen mit Filterscheibe und Rennilase-Lösung aus dem Stomacher entfernt und mit einer Schere geöffnet. Die Flüssigkeit wird in ein Larvenzählbecken oder eine Petrischale gegossen. Der Beutel wird mit 5 bis 10 ml Wasser ausgewaschen, das ebenfalls in das Larvenzählbecken zur trichinoskopischen Prüfung oder in eine Petrischale zur stereomikroskopischen Untersuchung gegossen wird.
Die Sedimente müssen untersucht werden, sobald sie vorbereitet sind. Die Untersuchung darf unter keinen Umständen auf den nächsten Tag verschoben werden. Anmerkung: Die Filterscheiben dürfen nur verwendet werden, wenn sie vollständig sauber sind. Die Filterscheiben dürfen nie in unsauberem Zustand trocknen. Zum Säubern können sie über Nacht in Rennilase-Lösung gelegt werden. Vor der Verwendung sind sie im Stomacher in Rennilase-Lösung zu reinigen.
mit 50 Quadraten markierte tabletts zur Aufbewahrung von Proben von je ca. 2 g Fleisch oder andere Instrumente, welche die Rückverfolgbarkeit der Proben auf gleichwertige Weise sicherstellen;
Trichomatic-35®-Mixer mit Filtereinsatz;
8,5 %ige Salzsäurelösung (± 0,5 Gewichtsprozent);
transparente Polykarbonatmembranfilter mit 50 mm Durchmesser und 14 Mikron Porengröße;
Pepsin, Stärke 1: 10 000 NF (US National Formulary) entsprechend 1: 12 500 BP (British Pharmacopoeia) und entsprechend 2 000 FIP (International Pharmaceutical Federation) oder stabilisiertes flüssiges Pepsin mit mindestens 660 Einheiten/ml (Europäisches Arzneibuch);
eine auf 0,1 g genaue Waage;
Pinzette mit flacher Spitze;
eine Reihe von Objektträgern für die Mikroskopie mit einer Seitenlänge von mindestens 5 cm oder eine Reihe von Petrischalen mit einem Durchmesser von mindestens 6 cm, deren Boden mit einem spitzen Gegenstand in Quadrate von 10 × 10 mm eingeteilt ist;
ein (Stereo-)Durchlichtmikroskop (15- bis 60-fache Vergrößerung) oder ein Trichinoskop mit Horizontaltisch;
ein Eimer zum Auffangen der flüssigen Abfälle;
eine Reihe von 10-Liter-Gefäßen zur Dekontamination der Geräte, beispielsweise mit Formol, und für die Verdauungsflüssigkeit, wenn ein positiver Befund festgestellt wird;
ein Thermometer, das im Bereich 1 bis 100 °C auf ± 0,5 °C genau ist.
Der Mischer mit dem Filtereinsatz wird positioniert, der Abfallschlauch angeschlossen und zum Eimer geführt.
Beim Einschalten des Mixers beginnt das Aufheizen.
Zuvor ist das Bodenventil unter der Reaktionskammer zu öffnen und wieder zu schließen.
Dann werden bis zu 35 Proben von jeweils etwa 1 g (bei 25 bis 30 °C ) hinzugefügt, die gemäß Nummer 2 aus jeder einzelnen Probe entnommen werden. Es ist darauf zu achten, dass größere Sehnenstücke entfernt werden, da diese den Membranfilter verstopfen könnten.
Eine mit dem Mixer verbundene Flüssigkeitskammer wird bis zum Rand gefüllt (etwa 400 ml).
Die kleinere verbundene Flüssigkeitskammer wird bis zum Rand mit Salzsäure ((8,5 %) gefüllt (etwa 30 ml).
Ein Membranfilter wird unter den Grobfilter im Filterhalter in den Filtereinsatz gesetzt.
Schließlich werden 7 g Pepsin oder 21 ml flüssiges Pepsin hinzugefügt. Diese Reihenfolge ist streng einzuhalten, um die Zersetzung des Pepsins zu vermeiden.
Der Deckel der Reaktions- und der Flüssigkeitszellen wird geschlossen.
Jetzt wird die Digestionszeit eingestellt. Eine kurze Digestionsdauer (5 Minuten) ist für Schweine im normalen Schlachtalter, für andere Proben eine längere Dauer (8 Minuten) einzustellen.
Wird der Startknopf des Mixers betätigt, beginnt die automatische Aufbereitung und Verdauung, gefolgt von der Filtration. Das Verfahren ist nach 10 bis 13 Minuten abgeschlossen und kommt automatisch zum Stillstand.
Der Deckel der Reaktionskammer wird geöffnet, wenn sichergestellt ist, dass die Kammer leer ist. Befinden sich noch Schaum oder Verdauungsflüssigkeit in der Kammer, ist das Verfahren gemäß Abschnitt V zu wiederholen.
Ist das Ergebnis positiv, wird die Reaktionskammer des Mixers zu zwei Dritteln mit kochendem Wasser gefüllt. Die verbundene Flüssigkeitskammer wird mit gewöhnlichem Leitungswasser gefüllt, bis die untere Markierung bedeckt ist. Die Reinigung erfolgt dann automatisch. Der Filterhalter wird zusammen mit den übrigen Gerätschaften dekontaminiert, z.B. durch Formolbehandlung.
Am Ende des Tages wird die Flüssigkeitskammer im Mixer mit Wasser gefüllt und ein Standardprogramm durchgeführt.
Jeder Polycarbonat-Membranfilter darf höchstens fünfmal verwendet werden. Der Filter ist vor der nächsten Benutzung zu wenden. Außerdem ist der Filter nach jeder Benutzung auf etwaige Schäden zu untersuchen, die eine Weiterverwendung ausschließen würden.
V. Bei unvollständiger Verdauung anzuwendendes Verfahren, wenn keine Filtration erfolgen kann
Nachdem der Mixer einen automatischen Zyklus gemäß C 3 I durchlaufen hat, wird der Deckel der Reaktionskammer geöffnet und geprüft, ob Schaum oder Flüssigkeitsreste in der Kammer verblieben sind. Ist dies der Fall, wird wie folgt weiterverfahren:
Das Bodenventil unter der Reaktionskammer wird geschlossen.
Der Filterhalter wird abgenommen, und der Membranfilter wird auf einen Objektträger oder eine Petrischale übertragen.
In den Filterhalter wird ein neuer Membranfilter gesteckt; der Filterhalter wird wieder befestigt.
Die Flüssigkeitskammer des Mixers wird mit Wasser gefüllt, bis die untere Markierung bedeckt ist.
Der automatische Reinigungszyklus wird durchgeführt.
Nach Abschluss des Reinigungszyklus wird der Deckel der Reaktionskammer geöffnet; es wird überprüft, ob sich noch Flüssigkeitsreste darin befinden.
Ist die Kammer leer, wird der Filterhalter abgenommen; der Membranfilter wird mit einer Pinzette auf einen Objektträger oder eine Petrischale übertragen.
Die beiden Membranfilter werden gemäß Ziffer ii geprüft. Können die Filter nicht untersucht werden, ist der gesamte Verdauungsprozess mit einer längeren Verdauungszeit gemäß C 3 II zu wiederholen.
Ist das Ergebnis positiv oder nicht eindeutig, gelten die Bestimmungen von Kapitel I Nummer 3 Abschnitt III.
D. Magnetrührverfahren für die künstliche Verdauung von Sammelproben/"On-Filter-Isolation"-Technik und Larvennachweis mittels eines Latexagglutinationstests14
Dieses Verfahren wird nur für die Untersuchung des Fleisches von Hausschweinen als gleichwertig erachtet.
mit 50 Quadraten markierte tabletts zur Aufbewahrung von Proben von je ca. 2 g Fleisch oder andere Instrumente, welche die Rückverfolgbarkeit der Proben auf gleichwertige Weise sicherstellen;
Mixer, mit scharfer Klinge. Falls die Proben schwerer als 3 g sind, ist ein Fleischwolf mit Öffnungen von 2 bis 4 mm Größe oder eine Schere zu verwenden. Im Fall von Gefrierfleisch oder Zunge (nach Entfernung der unverdaulichen Oberflächenschicht) ist ein Fleischwolf erforderlich, und die Größe der Proben muss erheblich gesteigert werden;
Magnetrührer mit temperaturgeregelter Heizplatte und teflonbeschichteten Rührstäben von ungefähr 5 cm Länge;
3 Liter fassende Glasbecher;
Siebe, Maschenweite 180 Mikron, Außendurchmesser 11 cm, mit Maschen aus rostfreiem Stahl;
Filtrationsgerät aus Stahl für Maschenfilter einer Größe von 20 μm mit einem Stahltrichter;
Vakuumpumpe;
Metall- oder Kunststoffbehälter, Fassungsvermögen 10-15 Liter, zum Auffangen der Verdauungsflüssigkeit;
ein 3D-Schüttler;
Aluminiumfolie;
25 %ige Salzsäure;
Pepsin, Stärke 1: 10 000 NF (US National Formulary) entsprechend 1: 12 500 BP (British Pharmacopoeia) und entsprechend 2 000 FIP (International Pharmaceutical Federation) oder stabilisiertes flüssiges Pepsin mit mindestens 660 Einheiten/ml (Europäisches Arzneibuch);
Leitungswasser, auf 46 bis 48 °C erhitzt;
eine auf 0,1 g genaue Waage;
Pipetten in verschiedenen Größen (1, 10 und 25 ml), Mikropipetten entsprechend den Anweisungen des Herstellers der Latexagglutinationstests sowie Pipettenhalter;
Nylon-Maschenfilter (20 µm) mit einem zum Filtrationsgerät passenden Durchmesser;
Zange aus Kunststoff oder Stahl (10-15 cm);
konische Phiolen (15 ml);
ein in die konischen Phiolen passendes Pistill mit einem konischen Stopfen aus Teflon oder Stahl;
ein Thermometer, das im Bereich 1 bis 100 °C auf ± 0,5 °C genau ist;
Latexagglutinationskarten aus dem Trichin-L-Antigen-Test-Kit, das unter dem Code EURLP_D_001/2011 validiert wurde;
Pufferlösung mit Konservierungsstoff (Probenverdünnungsmittel) aus dem Trichin-L-Antigen-Test-Kit, das unter dem Code EURLP_D_001/2011 validiert wurde;
Puffer, ergänzt durch einen Konservierungsstoff (Negativkontrolle) aus dem Trichin-L-Antigen-Test-Kit, das unter dem Code EURLP_D_001/2011 validiert wurde;
Puffer, ergänzt durch Trichinellaspiralis-Antigene und einen Konservierungsstoff (Positivkontrolle) aus dem Trichin-L-Antigen-Test-Kit, das unter dem Code EURLP_D_001/2011 validiert wurde;
Puffer mit Polystyrolpartikeln, beschichtet mit Antikörpern und ergänzt durch einen Konservierungsstoff (Latexperlen) aus dem Trichin-L-Antigen-Test-Kit, das unter dem Code EURLP_D_001/2011 validiert wurde;
I. Vollständige Ansätze (gleichzeitige Untersuchung von Proben mit einem Gesamtgewicht von 100 g)
16 ± 0,5 ml 25 %ige Salzsäure (0,2 % Endkonzentration) wird in einen 3-l-Behälter mit 2,0 l ± 200 ml Leitungswasser gegeben, auf 46 bis 48 °C vorerhitzt; ein Rührstab wird im Behälter platziert, der Behälter wird auf die vorgeheizte Platte gestellt und der Rührvorgang gestartet.
10 ± 1 g Pepsinpulver (oder 30 ± 3 ml flüssiges Pepsin) werden hinzugefügt.
100-115 g Proben, die gemäß Nummer 2 zusammengestellt wurden, werden im Mixer mit 150 ml ± 15 ml vorerhitztem Verdauungspuffer zerkleinert.
Das zerkleinerte Fleisch wird in einen 3-l-Behälter gegeben, der Wasser, Pepsin und Salzsäure enthält.
Das Schneidewerk des Mixers wird mehrfach in die Verdauungsflüssigkeit des Behälters eingetaucht, und die Mixerschüssel wird mit einer kleinen Menge der Verdauungsflüssigkeit ausgespült, um noch anhängendes Fleisch zu entfernen.
Der Behälter wird mit Aluminiumfolie abgedeckt.
Der Magnetrührer ist so einzustellen, dass er während des gesamten Rührvorgangs eine konstante Temperatur von 44 bis 46 °C hält. Während des Rührvorgangs muss die Verdauungsflüssigkeit so schnell drehen, dass ein tiefer zentraler Wirbel entsteht, ohne dass Flüssigkeit herausspritzt.
Die Verdauungsflüssigkeit wird gerührt, bis die Fleischpartikel verschwinden (etwa 30 min). Danach wird das Rührgerät abgeschaltet und die Verdauungsflüssigkeit durch das Sieb in den Sedimentierungsfilter zur Sedimentation gegossen. Bei der Verarbeitung bestimmter Fleischarten (Zunge, Wildfleisch usw.) können längere Verdauungszeiten erforderlich sein (nicht mehr als 60 Minuten).
Der Verdauungsvorgang gilt als zufriedenstellend, wenn nicht mehr als 5 % des ursprünglichen Gewichts der Probe auf dem Sieb bleiben.
Der Nylon-Maschenfilter (20 µm) wird auf dem Filterhalter angebracht. Der konische Filtrationstrichter aus Stahl wird mit Hilfe des Blockiersystems am Filterhalter befestigt und das Stahlsieb (Maschenweite 180 µm) auf dem Trichter angebracht. Die Vakuumpumpe wird an den Filterhalter und den Metall- bzw. Kunststoffbehälter angeschlossen, damit die Verdauungsflüssigkeit aufgefangen werden kann.
Das Rühren wird gestoppt und die Verdauungsflüssigkeit durch das Sieb in den Filtrationstrichter gegossen. Der Behälter wird mit ca. 250 ml warmem Wasser gespült. Nach der Filtration der Verdauungsflüssigkeit wird die Spülflüssigkeit in die Filtrationsrampe gegossen.
Die Filtrationsmembran wird mit der Pinzette an einer Seite gehalten. Die Membran wird mindestens 4- fach gefaltet und in die 15 ml fassende konische Phiole eingeführt. Die konische Phiole ist entsprechend dem Pistill zu wählen.
Die Filtrationsmembran wird in der 15 ml fassenden konischen Phiole mit Hilfe des Pistills nach unten geschoben, anschließend wird durch Vorwärts- und Rückwärtsbewegen des Pistills (ca. 20-mal) starker Druck auf die Membran ausgeübt; dabei sollte sich das Pistill entsprechend den Anweisungen des Herstellers innerhalb der gefalteten Filtrationsmembran befinden.
0,5 ml ± 0,01 ml des Probenverdünnungsmittels werden mit einer Pipette in die 15 ml fassende konische Phiole gegeben und die Filtrationsmembran durch leichtes, wiederholtes Vorwärts- und Rückwärtsbewegen des Pistills ca. 30 s lang homogenisiert; hierbei sind entsprechend den Anweisungen des Herstellers abrupte Bewegungen zu vermeiden, um das Verspritzen der Flüssigkeit zu begrenzen.
Alle Proben, die negative und die positive Kontrolle werden entsprechend den Anweisungen des Herstellers mit Pipetten auf verschiedene Felder der Agglutinationskarte verteilt.
Die Latexperlen werden entsprechend den Anweisungen des Herstellers mit einer Pipette in jedes Feld der Agglutinationskarte zugegeben, wobei sie nicht mit den Proben und Kontrollen in Kontakt kommen dürfen. Dann werden die Latexperlen in jedem Feld vorsichtig mit Hilfe eines Wegwerfstäbchens vermischt, bis die homogene Flüssigkeit das ganze Feld bedeckt.
Die Agglutinationskarte wird auf dem 3D-Schüttler positioniert und entsprechend den Anweisungen des Herstellers 10 ± 1 min geschüttelt.
Nach dem in den Anweisungen angegebenen Zeitraum wird der Schüttelvorgang beendet, die Agglutinationskarte wird auf eine ebene Oberfläche gelegt und die Reaktionsergebnisse werden sofort entsprechend den Anweisungen des Herstellers abgelesen. Im Fall einer positiven Probe müssen sich Perlenaggregate zeigen. Im Fall einer negativen Probe bleibt die Suspension homogen ohne Perlenaggregate.
II. Ansätze mit einem Gesamtgewicht von weniger als 100 g gemäß Kapitel I Nummer 3 Abschnitt II
Bei Ansätzen mit einem Gesamtgewicht von weniger als 100 g ist das Verfahren gemäß Kapitel I Nummer 3 Abschnitt II anzuwenden.
Ergibt die Untersuchung einer Sammelprobe ein positives oder nicht eindeutiges Ergebnis des Latexagglutinationstests, so wird jedem Schwein eine weitere Probe von 20 g gemäß Kapitel I Nummer 2 Buchstabe a entnommen. Die jeweils 20 g schweren Proben von fünf Schweinen werden zusammengefasst und nach dem Verfahren gemäß Abschnitt I untersucht. Auf diese Weise werden Proben von 20 Gruppen zu je fünf Schweinen untersucht.
Im Fall eines positiven Latexagglutinationstests bei einer Gruppenprobe von fünf Schweinen wird von jedem Schwein dieser Gruppe eine weitere Probe von 20 g entnommen und nach einem der in Abschnitt I beschriebenen Verfahren einzeln untersucht.
Im Fall eines positiven oder nicht eindeutigen Latexagglutinationstests werden mindestens 20 g Schweinemuskeln zur Bestätigung anhand einer der in Kapitel I beschriebenen Methoden in das nationale Referenzlabor gesendet.
Parasitenproben werden zur Konservierung und zur Identifizierung der Erregerart im EU-Referenzlabor oder im nationalen Referenzlabor in 90 %igem Ethylalkohol aufbewahrt.
Nach Entnahme der Parasiten werden Flüssigkeiten mit positivem Befund durch Erhitzen auf mindestens 60 °C dekontaminiert.
IV. Reinigung und Dekontamination nach positivem oder nicht eindeutigem Befund.
Ergibt die Untersuchung einer Sammelprobe oder einer Einzelprobe ein positives oder nicht eindeutiges Ergebnis des Latexagglutinationstests, so wird alles Material, das mit Fleisch in Berührung kommt (Mixerschüssel und Messer, Pistill, Behälter, Rührstab, Temperatursensor, konischer Filtrationstrichter, Sieb und Pinzette) sorgfältig dekontaminiert, indem es einige Sekunden lang in heißes Wasser (65-90 °C) getaucht wird. Fleischreste oder inaktivierte Larven, die sich noch auf den Oberflächen befinden könnten, können mit einem sauberen Schwamm und Leitungswasser entfernt werden. Erforderlichenfalls können einige Tropfen eines Reinigungsmittels zugefügt werden, um die Geräte und Ausrüstungsteile zu entfetten. Es wird empfohlen, danach alle Gegenstände gründlich zu spülen, damit alle Reste des Reinigungsmittels entfernt werden.
E. Prüfung durch künstliche Digestion für den Invitro-Nachweis von Larven der Trichinella spp. in Fleischproben, PrioCHECK® Trichinella AAD Kit14
Dieses Verfahren wird nur für die Untersuchung des Fleisches von Hausschweinen als gleichwertig erachtet.
Das PrioCHECK® Trichinella AAD Kit ist entsprechend dem Anleitungshandbuch des Kits unter Verwendung von Scheidetrichtern (Lenz NS 29/32) und eines 80-ml-Reagenzglases anzuwenden.
Glühlampentrichinoskop mit 30- bis 40-facher und 80- bis 100-facher Vergrößerung oder ein Stereomikroskop mit in der Intensität einstellbarer Durchlichtquelle;
Kompressorium, d. h. Quetschglas, bestehend aus zwei Glasplatten (von denen eine in gleich große Felder unterteilt ist);
kleine gebogene Schere;
kleine Zange;
Messer zum Probenausschneiden;
kleine nummerierte Behälter zur getrennten Aufnahme der Proben;
eine Tropfpipette;
je ein Glas mit Essigsäure und Kalilauge zum Aufhellen von etwaigen Verkalkungen und Erweichen von eingetrocknetem Fleisch.
Bei ganzen Schlachtkörpern sind mehrere haselnussgroße Proben von jedem Tier auszuschneiden:
Bei Hausschweinen werden diese Proben entnommen aus beiden Zwerchfellpfeilern am Übergang vom muskulösen in den sehnigen Teil.
Bei Wildschweinen werden Proben aus beiden Zwerchfellpfeilern am Übergang vom muskulösen in den sehnigen Teil sowie vom Kiefer, der Unterschenkelmuskulatur, der Zwischenrippenfellmuskulatur und der Zungenmuskulatur entnommen, insgesamt sechs Proben von jedem einzelnen Tier.
Stehen einige Muskeln nicht zur Probenentnahme zur Verfügung, sind von den verfügbaren Muskelpartien insgesamt vier Proben zu nehmen.
Bei Fleischteilen sind vier haselnussgroße Proben von quer gestreiftem Muskelgewebe, möglichst fettfrei, an verschiedenen Stellen desselben Stücks zu entnehmen, möglichst in der Nähe von Knochen oder Sehnen.
Generell wird ein Kompressorium mit 1,0 ± 0,1 g Fleisch gefüllt, das entspricht normalerweise 28 haferkorngroßen Stückchen. Gegebenenfalls sind zwei Kompressorien mit insgesamt 56 haferkerngroßen Stücken zu füllen.
Sind bei Hausschweinen beide Zwerchfellpfeiler vorhanden, schneidet der Trichinenschauer jeweils 28 haferkorngroße Stückchen aus beiden genannten Teilen eines ganzen Schlachtkörpers aus, mithin im Ganzen 56 Stücke.
Ist nur ein Zwerchfellpfeiler vorhanden, werden 56 Stückchen an verschiedenen Stellen ausgeschnitten, möglichst am Übergang vom muskulösen in den sehnigen Teil.
Die Proben von den anderen vier Muskelpartien von Wildschweinen werden jeweils in sieben haferkorngroße Stückchen zerteilt, so dass weitere 28 Stücke vorliegen.
Der Trichinenschauer presst die 56 (oder 84) Stückchen dann zwischen den Gläsern des Quetschglases so ein, dass durch das Präparat gewöhnliche Druckschrift deutlich zu lesen ist.
Ist das Fleisch der zu untersuchenden Stücke trocken und alt, so sind die Präparate vor dem Quetschen 10 bis 20 Minuten mit Kalklauge zu erweichen, die mit etwa der doppelten Menge Wasser verdünnt ist.
Von jeder der Proben aus einem Fleischstück entnimmt der Trichinenbeschauer 14 haferkorngroße Stückchen, mithin insgesamt 56 Stückchen.
Die mikroskopische Untersuchung hat so zu erfolgen, dass jedes Präparat bei 30- bis 40-facher Vergrößerung langsam und sorgfältig durchmustert wird.
Zeigen sich bei der Trichinoskopie verdächtige Bereiche, sind diese mit der stärksten Vergrößerung des Trichinoskops (80- bis 100fach) zu untersuchen.
Bei zweifelhaftem Befund ist die Untersuchung an weiteren Proben und Präparaten bis zur völligen Aufklärung fortzusetzen. Auf die trichinoskopische Untersuchung sind mindestens 6 Minuten zu verwenden.
Die Mindestuntersuchungszeiten schließen nicht die für die Probeentnahme und Anfertigung der Präparate erforderliche Zeit ein.
Mit dem Trichinoskop dürfen von einem Untersucher im Allgemeinen nicht mehr als 840 Stückchen pro Tag untersucht werden, das entspricht einer Untersuchung von 15 Hausschweinen oder 10 Wildschweinen.
Gefroren eingeführtes Fleisch ist in gefrorenem Zustand zu halten.
Die technische Ausrüstung und die Energieversorgung des Gefrierraums müssen gewährleisten, dass die erforderlichen Temperaturen in kürzester Zeit erreicht und in allen Teilen des Raums sowie im Fleisch aufrechterhalten werden.
Vor dem Gefrieren ist Isolierverpackung zu entfernen, ausgenommen bei Fleisch, das bereits beim Einbringen in den Gefrierraum die erforderliche Temperatur vollständig erreicht hat, sowie Fleisch, das so verpackt ist, dass es trotz der Verpackung innerhalb der vorgegebenen Zeit die erforderliche Temperatur erreicht.
Die Sendungen sind im Gefrierraum getrennt und unter Verschluss zu halten.
Datum und Uhrzeit des Einbringens einer Fleischsendung in den Gefrierraum sind aufzuzeichnen.
Die Temperatur im Gefrierraum darf nicht höher sein als -25 °C . Sie ist thermoelektrisch mit geeichten Geräten zu messen und fortlaufend aufzuzeichnen. Sie darf nicht direkt im Kaltluftstrom gemessen werden. Die Geräte sind unter Verschluss zu halten. Die Diagramme sind mit den einschlägigen Registernummern der Fleischuntersuchung bei der Einfuhr sowie Tag und Stunde des Beginns und der Beendigung des Gefrierprozesses zu versehen und nach der Zusammenstellung ein Jahr lang aufzubewahren.
Fleisch mit bis zu 25 cm Durchmesser oder Schichtdicke muss mindestens 240 Stunden ohne Unterbrechung gefroren sein; Fleisch mit 25 bis 50 cm Durchmesser oder Schichtdicke muss mindestens 480 Stunden ohne Unterbrechung gefroren sein. Fleisch mit einem größeren Durchmesser oder einer größeren Schichtdicke darf diesem Gefrierverfahren nicht unterzogen werden. Die Gefrierzeit ist ab dem Zeitpunkt zu berechnen, an dem die Temperatur im Gefrierraum den Wert gemäß Buchstaben f erreicht.
Es gelten die allgemeinen Bestimmungen der Buchstaben a bis e des Verfahrens 1 unter Anwendung folgender Zeit-/Temperaturkombinationen:
Fleisch mit einem Durchmesser oder einer Schichtdicke bis zu 15 cm ist nach einer der folgenden Zeit/ Temperaturkombinationen einzufrieren:
20 Tage bei minus 15 °C,
10 Tage bei minus 23 °C,
6 Tage bei minus 29 °C .
Fleisch mit einem Durchmesser oder einer Schichtdicke von 15 bis 50 cm ist nach einer der folgenden Zeit-/Temperaturkombinationen einzufrieren:
30 Tage bei minus 15 °C,
20 Tage bei minus 25 °C,
12 Tage bei minus 29 °C .
Die Temperatur im Gefrierraum darf die für die Abtötung gewählte Temperatur nicht überschreiten. Sie ist thermoelektrisch mit geeichten Geräten zu messen und fortlaufend aufzuzeichnen. Sie darf nicht direkt im Kaltluftstrom gemessen werden. Die Geräte sind unter Verschluss zu halten. Die Diagramme sind mit den
einschlägigen Registernummern der Fleischuntersuchung bei der Einfuhr sowie Tag und Stunde des Beginns und der Beendigung des Gefrierprozesses zu versehen und nach der Zusammenstellung ein Jahr lang aufzubewahren.
Werden Gefriertunnel verwendet und die vorstehenden Verfahren nicht strikt eingehalten, muss der Betreiber des Lebensmittelunternehmens in der Lage sein, der zuständigen Behörde gegenüber nachzuweisen, dass das alternative Verfahren die Abtötung von Trichinenparasiten in Schweinefleisch gewährleistet.
Die Behandlung erfolgt durch handelsübliches Gefriertroknen oder kontrolliertes Gefrieren nach vorgegebenen Zeit-Temperatur-Kombinationen, wobei die Temperatur jeweils in der Mitte des Fleischstücks überwacht wird.
Es gelten die allgemeinen Bestimmungen der Buchstaben a bis e des Verfahrens 1 unter Anwendung folgender Zeit-/Temperaturkombinationen:
106 Stunden bei minus 18 °C,
82 Stunden bei minus 21 °C,
63 Stunden bei minus 23,5 °C,
48 Stunden bei minus 26 °C,
35 Stunden bei minus 29 °C,
22 Stunden bei minus 32 °C,
8 Stunden bei minus 35 °C,
0,5 Stunden bei minus 37 °C .
Die Temperatur ist thermoelektrisch mit geeichten Geräten zu messen und fortlaufend aufzuzeichnen. Die Messsonde ist in den Kern eines Fleischstücks einzuführen, das nicht kleiner sein darf als das dickste einzufrierende Fleischstück. Das Fleischstück ist an der ungünstigsten Stelle des Gefrierraums zu platzieren, d. h. vom Kühlaggregat entfernt und nicht unmittelbar im Kaltluftstrom. Die Geräte sind unter Verschluss zu halten. Die Diagramme sind mit den einschlägigen Registernummern der Fleischuntersuchung bei der Einfuhr sowie Tag und Stunde des Beginns und der Beendigung des Gefrierprozesses zu versehen und nach der Zusammenstellung ein Jahr lang aufzubewahren.
Fleisch von Pferden, frei lebendem Wild und anderen Tieren, das Trichinenparasiten enthalten könnte, ist vorbehaltlich folgender Änderungen nach einem der Verdauungsverfahren gemäß Anhang I Kapitel I oder II zu untersuchen:
Dem Zungen- oder Kiefermuskel von Pferden und dem Antebrachium, der Zunge oder dem Zwerchfell von Wildschweinen sind Proben von mindestens 10 g zu entnehmen.
Fehlt diese Muskulatur beim Pferd, so ist eine größere Probe aus einem Zwerchfellpfeiler am Übergang vom muskulösen in den sehnigen Teil auszuschneiden. Der Muskel muss frei sein von Bindegewebe und Fett.
Eine mindestens 5 g schwere Probe wird nach dem Referenznachweisverfahren in Anhang I Kapitel I oder einem gleichwertigen Verfahren gemäß Kapitel II verdaut. Bei jedem Verdauungsvorgang darf das Gesamtgewicht des untersuchten Muskels 100 g bei dem Verfahren in Kapitel I sowie bei den Verfahren a und B in Kapitel II und 35 g bei Verfahren C in Kapitel II nicht überschreiten.
Bei positivem Untersuchungsergebnis ist zwecks anschließender unabhängiger Untersuchung eine weitere 50 g schwere Probe zu entnehmen.
Jegliches Fleisch von anderem Wild als Wildschweinen, wie Bären, Fleisch fressenden Säugetieren, Reptilien und Meeressäugern, ist unbeschadet artenschutzrechtlicher Bestimmungen zu untersuchen, indem Proben von 10 g der Muskulatur an der Prädilektionsstelle oder, falls diese nicht zur Verfügung stehen, größere Mengen an anderen Stellen entnommen werden. Prädilektionsstellen sind:
beim Bären: Zwerchfell, Kaumuskel und Zunge;
beim Walross: Zunge;
beim Krokodil: Kaumuskel, Musculi pterygoidei und Zwischenrippenmuskulatur;
bei Vögeln: Kopfmuskeln (z.B. Kaumuskeln und Halsmuskulatur).
Die Verdauungszeit muss lang genug sein, dass die Gewebe dieser Tiere vollständig verdaut werden können, darf aber 60 Minuten nicht überschreiten.
Kapitel I14 Amtliche Anerkennung eines Haltungsbetriebs oder eines Kompartiments mit kontrollierten Haltungsbedingungen
A. Ein Lebensmittelunternehmer muss folgende Bedingungen erfüllen, um die amtliche Anerkennung eines Betriebs zu erlangen:
Er muss alle praktischen Vorkehrungen in Bezug auf Bauverfahren und Wartung getroffen haben, um zu verhindern, dass Nagetiere, sonstige Säugetiere und fleischfressende Vögel Zugang zu Gebäuden haben, in denen Tiere gehalten werden.
Er muss ein Schädlingsbekämpfungsprogramm, insbesondere gegen Nagetiere, durchführen, um Infestationen von Schweinen wirksam vorzubeugen. Er muss den Vorgaben der zuständigen Behörde entsprechende Aufzeichnungen über das Programm führen.
Er muss sicherstellen, dass alle Futtermittel aus einer Einrichtung bezogen werden, die Futtermittel gemäß den in der Verordnung (EG) Nr. 183/2005 des Europäischen Parlaments und des Rates * beschriebenen Grundsätzen herstellt.
Er muss Futtermittel für trichinenempfängliche Tierarten in geschlossenen Silos oder anderen Behältern lagern, in die keine Nagetiere eindringen können. Alle anderen Futtermittel sind einer Wärmebehandlung zu unterziehen oder nach Vorgabe der zuständigen Behörde herzustellen und zu lagern.
Er muss sicherstellen, dass tote Tiere unverzüglich gesammelt, gekennzeichnet und transportiert werden gemäß den Artikeln 21 und 22 der Verordnung (EG) Nr. 1069/2009 des Europäischen Parlaments und des Rates ** sowie gemäß Anhang VIII der Verordnung (EU) Nr. 142/2011 der Kommission ***.
Befindet sich in der Nähe des Betriebs eine Mülldeponie, so muss der Unternehmer die zuständige Behörde informieren. Die zuständige Behörde bewertet die Risiken und entscheidet, ob der Betrieb als Haltungsbetrieb mit kontrollierten Haltungsbedingungen anerkannt werden kann.
Er muss dafür sorgen, dass Hausschweine gekennzeichnet sind, so dass jedes Tier zum Betrieb zurückverfolgt werden kann.
Er muss dafür sorgen, dass Hausschweine nur dann in den Betrieb aufgenommen werden, wenn sie ihren Ursprung in Betrieben haben, die als Haltungsbetriebe mit kontrollierten Haltungsbedingungen amtlich anerkannt sind, und von dort kommen.
Keines der Hausschweine hat Zugang zu Einrichtungen im Freien, es sei denn, der Lebensmittelunternehmer kann der zuständigen Behörde durch eine Risikoanalyse nachweisen, dass die Dauer, die Einrichtungen und die Umstände des Zugangs ins Freie hinsichtlich der Einschleppung von Trichinen in den Betrieb keine Gefahr darstellen.
Keines der Zucht- und Nutzschweine gemäß Artikel 2 Absatz 2 Buchstabe c der Richtlinie 64/432/EWG wurde nach Verlassen des Ursprungsbetriebs in einer Sammelstelle gemäß Artikel 2 Absatz 2 Buchstabe o der Richtlinie 64/432/EWG entladen, es sei denn, die Sammelstelle genügt den Buchstaben a bis i dieses Teils und alle Hausschweine, die in der Sammelstelle für Sendungen gruppiert werden, haben ihren Ursprung in Betrieben, die als Haltungsbetriebe mit kontrollierten Haltungsbedingungen amtlich anerkannt sind, und kommen von dort oder von amtlich anerkannten Kompartimenten.
B. Lebensmittelunternehmer von Haltungsbetrieben mit amtlich anerkannt kontrollierten Haltungsbedingungen informieren die zuständige Behörde, sobald eine der Anforderungen gemäß Buchstabe a nicht mehr erfüllt ist oder sonstige Änderungen aufgetreten sind, die den Status des Betriebs beeinträchtigen könnten.
C. Die zuständigen Behörden in den Mitgliedstaaten dürfen einen Haltungsbetrieb oder eine Kategorie von Haltungsbetrieben nur anerkennen, wenn sie überprüft haben, dass die Anforderungen gemäß Buchstabe a erfüllt sind.
Kapitel II Berichterstattung über die Lage hinsichtlich Trichinen
Die Zahl (eingeschleppter und einheimischer) Trichinosefälle beim Menschen, einschließlich der epidemiologischen Daten, ist gemäß der Entscheidung 2000/96/EG der Kommission **** zu melden.
Die Anzahl der Tests und die Ergebnisse der Untersuchung auf Trichinen bei Hausschweinen, Wildschweinen, Pferden, Wild und anderen empfänglichen Tieren ist gemäß Anhang IV der Richtlinie 2003/99/EG zu melden. Die Daten zu Hausschweinen müssen mindestens zu folgenden Punkten Angaben enthalten:
Tests bei Tieren aus kontrollierten Haltungsbedingungen;
