umwelt-online: Verordnung (EG) Nr. 152/2009 zur Festlegung der Probenahmeverfahren und Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (5)

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A. Bestimmung des Methylbenzoquatgehalts

7-Benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-chinolon

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Methylbenzoquatgehalts von Futtermitteln. Die Bestimmungsgrenze beträgt 1 mg/kg.

2. Prinzip

Methylbenzoquat wird mit methanolischer Methansulfonsäure-Lösung aus der Probe extrahiert. Der Extrakt wird mit Dichlormethan, mittels Ionenaustauschchromatografie und anschließend erneut mit Dichlormethan gereinigt. Der Methylbenzoquatgehalt wird mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) unter Verwendung eines UV-Detektors bestimmt.

3. Reagenzien

3.1 Dichlormethan.

3.2 Methanol, HPLC-Qualität.

3.3 Mobile Phase für die HPLC

Gemisch aus Methanol ( 3.2) und Wasser (HPLC-Qualität) 75 + 25 (V+V).

Die Lösung wird durch einen 0,22- µm-Filter ( 4.5) filtriert und entgast (z.B. durch 10-minütige Ultraschallbehandlung).

3.4 Methansulfonsäure-Lösung, c = 2 %

20,0 ml Methansulfonsäure werden mit Methanol ( 3.2) auf 1.000 ml verdünnt.

3.5 Salzsäure, c = 10 %

100 ml Salzsäure (ρ₂₀1,18 g/ml) werden mit Wasser auf 1.000 ml verdünnt.

3.6. Kationenaustauschharz Amberlit CG-120 (Na), 100 bis 200 Mesh

Dieses Harz wird vor der Verwendung vorbehandelt. Von dem Harz werden 100 g mit 500 ml verdünnter Salzsäure ( 3.5) aufgeschlämmt und auf einer Heizplatte unter ständigem Rühren zum Sieden gebracht. Es wird abkühlen gelassen, und die Säure wird dekantiert. Anschließend wird durch einen Papierfilter unter Vakuum filtriert. Das Harz wird 2-mal mit je 500 ml Wasser und danach mit 250 ml Methanol ( 3.2) gewaschen. Anschließend wird das Harz nochmals mit 250 ml Methanol gespült und der Filterkuchen trocken gesaugt. Das getrocknete Harz wird in einer verschlossenen Flasche aufbewahrt.

3.7 Standardsubstanz: Methylbenzoquat (7-Benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-chinolon), rein

3.7.1 Methylbenzoquat-Standard-Stammlösung , 500 µg/ml

Von der Standardsubstanz ( 3.7) werden 50 mg auf 0,1 mg genau eingewogen, in einem 100-ml-Messkolben in methanolischer Methansulfonsäure ( 3.4) gelöst, zur Marke aufgefüllt und gemischt.

3.7.2 Methylbenzoquat-Standardlösung, 50 µ g/ml

Von der Methylbenzoquat-Standard-Stammlösung ( 3.7.1) werden 5,0 ml in einen 50-ml-Messkolben überführt. Es wird mit Methanol ( 3.2) zur Marke aufgefüllt und gemischt.

3.7.3 Kalibrierlösungen

Von der Methylbenzoquat-Standardlösung ( 3.7.2) werden 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 bzw. 5,0 ml jeweils in einen 25-ml-Messkolben überführt. Mit der mobilen Phase ( 3.3) wird zur Marke aufgefüllt und durchmischt. Diese Lösungen enthalten Methylbenzoquat in Konzentrationen von 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 bzw. 10,0 µg/ml. Die Lösungen müssen vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

4. Geräte

4.1 Laborschüttler.

4.2 Rotationsfilmverdampfer.

4.3 Glassäule (250 × 15 mm) mit Absperrhahn und Reservoir mit einem Fassungsvermögen von ca. 200 ml.

4.4 HPLC-Einrichtung mit UV-Detektor mit variabler Wellenlängeneinstellung oder Diodenarray-Detektor

4.4.1 HPLC-Trennsäule, 300 × 4 mm, C₁₈, 10 µm Korngröße, oder vergleichbare Säule.

4.5 Membranfilter, 0,22m Porengröße.

4.6 Membranfilter, 0,45m Porengröße.

5. Verfahren

5.1 Allgemeines

5.1.1 Zur Prüfung, dass weder Methylbenzoquat noch Störsubstanzen vorhanden sind, wird eine Blindprobe untersucht.

5.1.2 Die Wiederfindungsrate wird ermittelt, indem eine Blindprobe untersucht wird, die mit Methylbenzoquat angereichert wurde. Die zugesetzte Menge an Methylbenzoquat sollte der in der Probe vorhandenen Menge entsprechen. Zur Anreicherung auf einen Gehalt von 15 mg/kg werden 20 g der Blindprobe mit 600l Standard-Stammlösung ( 3.7.1) versetzt. Es wird gemischt und 10 min stehen gelassen, bevor mit der Extraktion ( 5.2) fortgefahren wird.

Für den Zweck dieser Methode muss die Blindprobe ähnlich zusammengesetzt sein wie die zu untersuchende Probe, und Methylbenzoquat darf nicht nachweisbar sein.

5.2 Extraktion

Von der vorbereiteten Probe werden 20 g auf 0,01 g genau in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingewogen. Nach Zugabe von 100,0 ml Methansulfonsäure-Lösung ( 3.4) wird mechanisch ( 4.1) 30 min geschüttelt. Die Lösung wird durch ein Filterpapier filtriert und das Filtrat für die Flüssig-Flüssig-Trennung ( 5.3