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Anhang 1 zur RL 67/548/EWG Anhang V C.13.

Chemische Eigenschaften eines geeigneten Verdünnungswassers

Anhang 2 zur RL 67/548/EWG Anhang V C.13.

Für den Test empfohlene Fischspezies

In verschiedenen Ländern wurden unterschiedliche Ästuarine- und Meeresspezies verwendet, beispielsweise:

Zusammenstellung

Die in obenstehender Tabelle aufgeführten Süßwasserfische sind leicht zu züchten oder stehen größtenteils ganzjährig zur Verfügung, wohingegen die Verfügbarkeit der Ästuarinen- und Meeresspezies teilweise auf bestimmte Länder beschränkt ist. Sie können entweder in Teichwirtschaften oder im Labor unter krankheits- und parasitenkontrollierten Bedingungen gezüchtet und aufgezogen werden, so daß man gesunde Versuchstiere hat, deren Abstammung bekannt ist. Diese Fische sind in vielen Teilen der Welt verfügbar.

Anhang 3 zur RL 67/548/EWG Anhang V C.13.

Vorhersage der Dauer der Aufnahme- und der Abbauphase

1 Vorhersage der Dauer der Aufnahmephase

Vor der Durchführung des Tests kann ein geschätzter Wert k₂ und damit ein prozentualer Teil der für die Erreichung des Fließgleichgewichts benötigten Zeit aus den empirischen Beziehungen zwischen k₂ und dem n-Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten (P_ow) bzw. zwischen k₂ und der Wasserlöslichkeit (s) abgeleitet werden.

So läßt sich k₂ (Tag^-1) beispielsweise anhand folgender empirischer Beziehung (1) schätzen:

log₁₀k₂ = -0,414 log₁₀(P_ow) + 1,47 (r² = 0,95) (Gleichung 1)

Für weitere Beziehungen siehe Literaturhinweise (2).

Ist der Verteilungskoeffizient (P_ow) nicht bekannt, kann dieser (3) anhand der bekannten Wasserlöslichkeit (s) der Substanz geschätzt werden:

log₁₀(P_ow) = 0,862 log₁₀(s) + 0,710 (r² = 0,994) (Gleichung 2)

wobei s = Löslichkeit (Mol/l) : (n = 36)

Diese Beziehungen gelten nur für Chemikalien mit log P_ow-Werten zwischen 2 und 6,5 (4).

Die Zeit bis zur Einstellung eines gewissen Prozentsatzes des Fließgleichgewichts kann - durch Anwendung des Schätzwertes k₂ - aus der allgemeinen kinetischen Gleichung, die die Aufnahme und die Ausscheidung (Kinetik erster Ordnung) beschreibt, abgeleitet werden:

dC_f / dt = k₁⋅ C_w - k₂ ⋅ C_f

oder, wenn C_w konstant ist:

C_f = k₁/ k₂ ⋅ C_w (1 - e^-k₂t) (Gleichung 3)

Bei Annäherung an das Fließgleichgewicht (t →∞) kann Gleichung 3 reduziert werden (5) (6) zu:

C_f = k₁ / k₂ ⋅ C_w oder C_f/C_w = k₁/k₂ = BCF

Damit stellt (k₁/k₂) ⋅ C_w eine Annäherung an die Konzentration in den Fischen im "Fließgleichgewicht" (C_f,s) dar.

Gleichung 3 kann umgeformt werden in:

C_f = C_f,s (1 - e^-k₂t) oder C_f / C_fs = 1 - e^-k₂t (Gleichung 4)

Bei Anwendung von Gleichung 4 kann die Zeit bis zur Herstellung eines gewissen Gleichgewichtsprozentsatzes vorhergesagt werden, wenn k₂ zuvor anhand der Gleichungen 1 oder 2 geschätzt wurde.

Als Richtschnur gilt, daß die statistisch optimale Dauer der Aufnahmephase für die Ableitung statistisch brauchbarer Daten (BCF_k) die Zeit ist, die benötigt wird, bis die gegen die lineare Zeit aufgetragene Logarithmuskurve der Prüfsubstanzkonzentration in den Fischen ihren Mittelpunkt bzw. 1,6/k₂ oder ein 80 %iges Fließgleichgewicht, jedoch nicht mehr als 3,0/k₂ oder 95 %iges Fließgleichgewicht (7) erreicht.

Die Zeit zur Herstellung eines 80 %igen Fließgleichgewichts entspricht (Gleichung 4):

0,80 = 1 - e^-k₂t80 oder t₈₀ = 1,6 / k₂ (Gleichung 5)

Dementsprechend gilt für ein 95 %iges Fließgleichgewicht:

t₉₅ = 3,0 / k₂ (Gleichung 6)

Demnach wäre beispielsweise die Dauer der Aufnahmephase (ap) für eine Prüfsubstanz mit log P_ow = 4 (unter Anwendung der Gleichungen 1, 5, 6):

log₁₀k₂ = -0,414 ⋅ (4) + 1,47 k₂ = 0,652 Tage^-1

ap (80 %) = 1,6 / 0,652, d.h. 2,45 Tage (59 Stunden)

oder ap (95 %) = 3,0 / 0,652; d. h. 4,60 Tage (110 Stunden).

Für eine Prüfsubstanz mit s = 10^-5 Mol/l (log(s) = -5,0) wäre die Dauer der ap (unter Anwendung der Gleichungen 1, 2, 5, 6) entsprechend:

log₁₀ (P_ow) = -0,862 7 ⋅ (-5,0) + 0,710 = 5,02

log₁₀k₂ = -0,414 ⋅ (5,02) + 1,47

k₂ = 0,246 Tage^-1

ap (80 %) = 1,6 / 0,246; d.h. 6,5 Tage (156 Stunden)

oder ap (95 %) = 3,0 / 0,246; d.h. 12,2 Tage (293 Stunden)

Alternativ kann der Ausdruck:

t_eq = 6,54 ⋅ 10^-3 P_ow + 55,31 (Stunden)

zur Berechnung der Zeit bis zur Herstellung des effektiven Fließgleichgewichts verwendet werden (4).

2 Vorhersage der Dauer der Ausscheidungsphase

Die Vorhersage der Zeit, die für die Reduzierung der Körperbelastung auf einen gewissen Prozentsatz der ursprünglichen Konzentration benötigt wird, kann auch aus der allgemeinen kinetischen Gleichung erster Ordnung über die Aufnahme und die Ausscheidung (1) (8) abgeleitet werden.

Für die Ausscheidungsphase wird C_w als Null angenommen. Die Gleichung kann reduziert werden zu:

dC_f / dt = -k₂C_f oder C_f = C_f,0 ⋅ e^-k₂t

wobei C_f,0 die Konzentration zu Beginn der Ausscheidungsperiode bezeichnet. Eine 50 %ige Ausscheidung wird dann erreicht bei (t₅₀):

C_f / C_f,0 = 1/2 = e^-k₂t50 oder t₅₀ = 0,693 / k₂

Dementsprechend wird eine 95 %ige Ausscheidung erreicht bei:

t₉₅ = 3,0 / k₂

Bei einer 80 %igen Aufnahme in der ersten Periode (1,6/k₂) und einem 95 %igen Verlust in der Ausscheidungsphase (3,0/k₂) wird die Ausscheidungsphase ungefähr doppelt solange wie die Aufnahmephase dauern.

Es ist jedoch wichtig festzuhalten, daß die Schätzungen auf der Annahme beruhen, daß die Aufnahme- und Ausscheidungsmuster einer Kinetik erster Ordnung folgen. Wenn es sich jedoch offensichtlich nicht um eine Kinetik erster Ordnung handelt, müssen komplexere Modelle verwendet werden (z.B. Literaturhinweis (1)).

Literaturhinweise (zu Anhang 3)

(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1 S. 309-320.

(2) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; inflünce of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.

(3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982) Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1) S. 4-10.

(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988) Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6) S. 701-707.

(5) Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975) Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4) S. 785-792.

(6) Ernst W. (1985) Accumulation in Aquatic Organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4 S. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N.Y.

(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. (1977) Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55 S. 614-622.

(8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980) Toxicokinetics in Fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9 S. 3-19.

Anhang 4 zur RL 67/548/EWG Anhang V C.13.

Theoretisches Beispiel für einen Probenahmeplan für Biokonzentrationstests bei Substanzen mit log P_ow =4

Anhang 5 zur RL 67/548/EWG Anhang V C.13.

Modelldiskriminierung

Man geht davon aus, daß die meisten Biokonzentrationsdaten durch ein einfaches Zwei-Kompartiment- /Zwei-Parameter- Modell "einigermaßen" gut dargestellt werden, wie aus der geradlinigen Kurve ersichtlich ist, die sich den Punkten für die Konzentrationen in den Fischen während der Ausscheidungsphase annähert, wenn diese auf semilogarithmischem Papier aufgetragen werden. (Wenn diese Punkte nicht durch eine geradlinige Kurve beschrieben werden können, sollten komplexere Modelle verwendet werden, siehe z.B. Spacie und Hamelink, Literaturhinweis 1 in Anhang 3).

Graphische Methode zur Bestimmung der Ausscheidungskonstanten k₂

Tragen Sie die in den einzelnen Fischproben festgestellten Prüfsubstanzkonzentrationen gegen die Probenahmezeit auf semilogarithmischem Papier ab. Die Neigung dieser Linie bezeichnet k₂.

Beachten Sie, daß Abweichungen von einer geraden Linie auf ein komplexeres Ausscheidungsmuster als eine Kinetik erster Ordnung hindeuten können. Für eine Auswertung von Ausscheidungsvorgängen, die nicht einer Kinetik erster Ordnung entspricht, kann eine graphische Methode gewählt werden.

Graphische Methode zur Bestimmung der Aufnahmekonstanten k₁

Bei gegebenem K₂ wird k₁ wie folgt berechnet:

(Gleichung 1)

Der Wert C_f wird vom Mittelpunkt der glatten Aufnahmekurve abgelesen, die entsteht, wenn die log Konzentration gegen die Zeit (auf einer arithmetischen Skala) aufgetragen wird.

Computergestütztes Verfahren zur Berechnung der Aufnahme- und Ausscheidungskonstanten

Für die Berechnung des Biokonzentrationsfaktors sowie der Geschwindigkeitskonstanten k₁ und k₂ wird der Einsatz computergestützter, nichtlinearer Verfahren zur Parameterschätzung bevorzugt. Diese Programme bestimmen die Werte k₁ und k₂ basierend auf einem gegebenen Satz von über die Zeit ermittelten Konzentrationsdaten und dem Modell:

(Gleichung 2)

(Gleichung 3)

wobei t_c die Zeit am Ende der Aufnahmephase bezeichnet.

Durch diesen Ansatz wird die Standardabweichung von k₁ und k₂ geschätzt.

Da k₂ zumeist anhand der Ausscheidungskurve mit relativ hoher Genauigkeit geschätzt werden kann und weil es eine starke Korrelation zwischen den beiden Parametern k und k₂ gibt, wenn sie gleichzeitig geschätzt werden, kann es u.U. ratsam sein, k₂ zunächst lediglich anhand der Ausscheidungsdaten abzuleiten und anschließend k₁ anhand der Aufnahmedaten mittels nichtlinearer Regression zu berechnen.

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