umwelt-online: Bestimmung der Toxizität

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B.15. 1. Methode

B.15. 1.1. Einleitung

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B.

B.15. 1.2. Definitionen

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B; B

B.15. 1.3. Bezugssubstanzen

Keine.

B.15. 1.4. Prinzip der Methode

Verschiedene haploide und diploide Stämme der Hefe Saccharomyces cerevisiae können zur Ermittlung chemisch induzierter Genmutationen verwendet werden. Die Versuche können sowohl mit oder ohne exogenes metabolisierendes System durchgeführt werden.

Vorwärtsmutationssysteme an haploiden Stämmen, wie die Messung der Mutation von roten, adeninabhängigen Mutanten (ade-1, ade-2) zu doppelt adeninabhängigen weißen Mutanten und Selektivsysteme, wie die Induktion einer Cycloheximid- und Kanavaninresistenz, werden verwendet.

Bei dem am besten validierten Rückmutationssystem wird der haploide Stamm XV 185-14C verwendet. Er weist die "ochre"-Nonsense-Mutationen ade 2-1,arg 4-17, lys 1-1 und trp 5-48,die durch basenaustauschmutagene, die ortsspezifische Mutationen oder "ochre"-Suppressor-Mutationen induzieren, reversibel sind. XV 185-14C weist außerdem den Marker his 1-7, eine Missense-Mutation, die hauptsächlich durch Mutationen an einem zweiten Genort reversibel ist, sowie den Marker hom 3-10 auf, der durch Rasterschubmutagene reversibel ist.

Der einzige gut validierte Stamm ist D₇, der für ilv 1-92 homozygot ist.

B.15. 1.5. Qualitätskriterien

Keine.

B.15. 1.6. Beschreibung der Methode

Vorbereitung

Die Prüfsubstanzen und die Kontroll- oder Bezugssubstanzen sind unmittelbar vor der Prüfung in einem geeigneten Lösungsmittel zu lösen. Bei wasserunlöslichen organischen Verbindungen sind organische Lösungsmittel wie Ethanol, Aceton und Dimethylsulfoxid (DMSO) zu verwenden, wobei die Konzentration 2 % v/v nicht überschreiten darf. Die Endkonzentration des Lösungsmittels soll die Überlebensrate und die Wachstumseigenschaften der Zellen nicht signifikant verändern.

Stoffwechselaktivierung

Die Behandlung der Zellen mit den Prüfsubstanzen sollte sowohl mit als auch ohne Zusatz eines geeigneten exogenen Stoffwechselaktivierungssystems erfolgen.

Das am häufigsten verwendete System ist eine durch Ko-Faktoren ergänzte post-mitochondriale Fraktion aus Lebern von Nagetieren, die mit enzyminduzierenden Agenzien vorbehandelt wurden. Auch andere Arten, Gewebe, post-mitochondriale Fraktionen oder Verfahren können sich für die Stoffwechselaktivierung eignen.

Versuchsbedingungen

Versuchsstämme

In Genmutationsuntersuchungen werden am häufigsten der haploide Stamm XV 185-14 C und der diploide Stamm D₇ verwendet. Auch andere Stämme können sich eignen.

Medien

Zur Bestimmung der Überlebensrate und Mutantenzahl sind geeignete Kulturmedien zu verwenden.

Verwendung von Negativ- und Positivkontrollen

Positivkontrollen, unbehandelte und Lösungsmittelkontrollen sind gleichzeitig anzulegen. Für jeden spezifischen Mutationsendpunkt sind geeignete Positivkontrollsubstanzen zu verwenden.

Konzentrationen

Es sind mindestens fünf deutlich unterschiedliche Konzentrationen der Prüfsubstanz zu verwenden. Bei toxischen Substanzen sollte die höchste Konzentration die Überlebensrate nicht unter 5 bis 10 % senken. Relativ wasserunlösliche Substanzen sind mit geeigneten Verfahren bis zur Löslichkeitsgrenze zu testen. Bei voll wasserlöslichen, nichttoxischen Substanzen ist die höchste Konzentration von Fall zu Fall festzulegen.

Inkubationsbedingungen

Die Platten werden für 4-7 Tage bei 28 bis 30 °C im Dunkeln inkubiert.

Häufigkeiten von Spontanmutationen

Es sind Subkulturen zu verwenden, in denen sich die Spontanmutationshäufigkeiten im üblichen Rahmen bewegen.

Anzahl der Platten

Mindestens 3 Platten pro Konzentration sind für den Nachweis prototropher Zellen, die durch Genmutation erzeugt werden, und zur Ermittlung der Überlebensrate anzulegen. Bei Versuchen, die Marker wie hom 3-10 mit einer geringen Mutationsrate verwenden, ist die Anzahl gleich behandelter Platten zu erhöhen, um statistisch relevante Daten zu erhalten.

Versuchsdurchführung

Die Behandlung von S. cerevisiae-Stämmen wird im allgemeinen mit einem Flüssigtest unter Verwendung von stationären oder wachsenden Zellen durchgeführt. Das Ausgangsexperiment sollte mit wachsenden Zellen durchgeführt werden. 1 bis 5 mal 10⁷ Zellen/ml werden bis zu 18 Stunden bei 28 bis 37 °C gegenüber der Prüfsubstanz unter Schütteln exponiert. Während der Behandlung wird eine angemessene Menge des exogenen metabolisierenden Systems beigefügt. Nach der Behandlung werden die Zellen zentrifugiert, gewaschen und auf einem geeigneten Kulturmedium ausgesät. Nach der Inkubation wird die Überlebensrate und die Genmutationsinduktion auf den Platten quantitativ erfaßt.

Sind die Befunde des ersten Experiments negativ, so ist ein weiterer Versuch durchzuführen mit Zellen, die sich in der stationären Phase befinden. Sind die Befunde des ersten Experiments positiv, so ist dies durch einen geeigneten unabhängigen Versuch zu bestätigen.

B.15. 2. Daten

Die Daten sind in tabellarischer Form darzustellen. Anzugeben sind die Anzahl der gezählten Konidien, die Anzahl der Mutanten, die Überlebensrate und die Mutantenhäufigkeit. Alle Ergebnisse sind in einem unabhängigen Versuch zu bestätigen. Die Auswertung der Daten sollte unter Verwendung geeigneter statistischer Methoden erfolgen.

B.15. 3. Abschlußbericht

B.15. 3.1. Prüfbericht
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

• verwendeter Stamm;
• Versuchsbedingungen: Zellen der stationären Phase oder wachsende Zellen, Medienzusammensetzung, Inkubationstemperatur und -dauer, Stoffwechselaktivierungssysteme;
• Behandlungsbedingungen: Konzentrationen, Behandlungsverfahren und -dauer, Behandlungstemperatur, Positiv- und Negativkontrollen;
• Anzahl der gezählten Kolonien, Anzahl der Mutanten, Überlebensrate und Mutantenhäufigkeit, ggf. Dosis-Wirkungs-Beziehung, statistische Auswertung der Daten;
• Diskussion der Ergebnisse;
• Bewertung der Ergebnisse.

B.15. 3.2. Interpretation

Siehe allgemeine Einleitung Teil B.

B.15. 4. Literatur

Siehe allgemeine Einleitung Teil B; H

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